论文摘要
目的:体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,研究MSCs生物学特性。观察丹参、藜芦水煎液诱导MSCs向神经元样细胞分化的作用,研究丹参、藜芦水煎液对分化后神经元样细胞SMNmRNA表达的影响;并采用血清药理学方法,研究丹参、藜芦含药血清诱导MSCs分化为神经元样细胞的作用。探索提高MSCs向神经元样细胞分化和上调分化后神经元样细胞SMNmRNA表达的干预因素,为进行神经元样细胞移植治疗脊髓。性肌萎缩症提供基础。方法:1.采用全骨髓贴壁法分离培养MSCs;通过形态学观察、绘制生长曲线、流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定和检测MSCs生长周期来鉴定MSCs;建立体外培养的稳定MSCs细胞株系。2.观察丹参、藜芦水煎液诱导MSCs向神经元样细胞分化的作用,免疫组化法检测神经元样细胞Nestin、NSE、GFAP,摸索β-巯基乙醇、丹参水煎液、藜芦水煎液、丹参+藜芦水煎液的最佳诱导浓度,观察各组最佳浓度诱导MSCs向神经元样细胞分化的作用。3.观察丹参、藜芦水煎液对分化后神经元样细胞SMNmRNA表达的影响,FQ-PCR法检测空白组、β-巯基乙醇诱导组、丹参水煎液组、藜芦丹参水煎液组、丹参+藜芦水煎液组对分化后神经元样细胞SMNmRNA表达的影响。4.观察丹参、藜芦含药血清诱导MSCs向神经元样细胞分化的作用,免疫组化法检测神经元样细胞Nestin、NSE、GFAP,摸索丹参含药血清、藜芦含药血清、丹参+藜芦含药血清的最佳诱导浓度,观察各组最佳浓度诱导MSCs向神经元样细胞分化的作用。结果:1.全骨髓贴壁法分离培养的MSCs具有均质性好、增殖活力强、传代生长快的特点。本实验培养的MSCs经流式细胞仪检测,表达整合素家族成员的CD29和粘附分子CD44,不表达泛白细胞标志CD45;MSCs处于G0-G1期的细胞为87.63%,G2-M期的细胞为3.57%,S期的细胞为8.80%:生长曲线均呈S形,接种1-3 d细胞的OD值变化不大,到第3 d细胞数目明显增加,第8 d到达顶点,之后减少;证实已成功建立稳定的MSCs株系。2.β-巯基乙醇、丹参水煎液、藜芦水煎液和丹参+藜芦水煎液最佳诱导MSCs向神经元样细胞分化浓度分别是β-巯基乙醇1mmol/L的无血清L-DMEM培养液、丹参水煎液120μl/ml10%胎牛血清L-DMEM培养液、藜芦水煎液140μl/ml 10%胎牛血清L-DMEM培养液和丹参+藜芦80μl/ml 10%胎牛血清L-DMEM培养液。空白组Nestin、NSE和GFAP表达均为阴性。丹参+藜芦水煎液组Ncstin阳性细胞率高于β-巯基乙醇组,P＜0.01;丹参+藜芦水煎液组NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组,P＜0.05;丹参+藜芦水煎液组Nestin、NSE阳性细胞率分别高于丹参水煎液和藜芦水煎液,P＜0.05;各实验组GFAP表达均为阴性。3.β-巯基乙醇组、丹参水煎液组、藜芦水煎液组、丹参+藜芦水煎液组分化后神经元样细胞SMNmRNA表达丰度值均高于空白组,P＜0.01;丹参+藜芦水煎液组SMNmRNA表达丰度值高于β-巯基乙醇组,P＜0.05:丹参+藜芦水煎液组SMNmRNA表达丰度值高于丹参水煎液组、藜芦水煎液组,P＜0.01;β-巯基乙醇组SMNmRNA表达丰度值高于丹参水煎液组、藜芦水煎液组,P＜0.05。4.丹参含药血清组、藜芦含药血清和丹参+藜芦含药血清最佳诱导MSCs向神经元样细胞分化浓度分别是丹参含药血清20μl/ml 10%胎牛血清L-DMEM培养液、藜芦含药血清25μl/ml 10%胎牛血清L-DMEM培养液和丹参+藜芦含药血清15μl/ml 10%胎牛血清L-DMEM培养液。空白组Ncstin、NSE和GFAP表达均为阴性。丹参+藜芦含药血清诱导组Nestin阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组,P＜0.05;丹参+藜芦诱导组NSE阳性细胞率高于β-巯基乙醇诱导组,P＜0.01;各实验组GFAP表达均为阴性。结论:1.运用全骨髓贴壁法,可以建立体外稳定培养的MSCs株系。2.丹参水煎液、丹参+藜芦水煎液可以诱导体外培养的MSCs向神经元样细胞分化,藜芦水煎液诱导MSCs向神经元样细胞分化作用不明显,丹参+藜芦水煎液诱导MSCs向神经元.样细胞分化作用高于其它诱导组,MSCs没有诱导因素的作用不会向神经元样细胞分化。3.丹参、藜芦水煎液可以促进分化后神经元样细胞表达SMNmRNA,丹参+藜芦水煎液对神经元样细胞SMNmRNA表达作用强于丹参水煎液或藜芦水煎液,分化后的神经元样细胞在丹参+藜芦水煎液干预下有向运动神经元细胞进一步分化的趋向。4.丹参+藜芦含药血清组促MSCs向神经元样细胞分化作用弱于丹参+藜芦水煎液组,原因可能是丹参+藜芦组水煎液经过大鼠机体代谢,含药血清中促MSCs向神经元样细胞分化作用的有效组份（群）降低所致。
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