Survivin、PEDF在恶性黑色素瘤中的表达及其在EGCG诱导A375细胞凋亡中的作用

论文摘要

第一部分Survivin、PEDF在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义目的探讨生存素（Survivin）及色素上皮源性因子（PEDF）在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及其临床意义。方法SP免疫组化法检测Survivin、PEDF蛋白在48例原发性皮肤恶性黑色素瘤中的表达水平，以23例色素痣作为对照。结果（1）Survivin在皮肤恶性黑色素瘤中的表达明显强于其在色素痣中的表达，PEDF在二者中的表达无明显差异，（2）Survivin和PEDF蛋白表达均与恶性黑色素瘤病理学类型、淋巴结转移、浸润深度及预后相关，（3）Survivin在黑色素瘤中的表达水平与PEDF呈明显负相关。结论Survivin与皮肤恶性黑色素瘤的发生发展密切相关，对皮肤恶性黑色素瘤的辅助诊断及预后评估具有重要的临床意义。PEDF在皮肤恶性黑色素瘤发展过程中可能起负性调节作用。第二部分EGCG对恶性黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响目的探讨EGCG对黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响。方法对人恶性黑色素瘤细胞株A375进行培养传代；活细胞计数法、MTT试验检测EGCG不同浓度和不同时间对A375细胞生长的抑制作用；用相差显微镜、电镜和Hochest核染色观察细胞凋亡的形态学改变；TUNEL法定量检测细胞凋亡；用Annexin V-FITC、PI双染分析细胞凋亡的变化；同时用DNA电泳观察凋亡的生化学改变。结果EGCG可明显抑制A375细胞的增殖，其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性；细胞凋亡形态学观察到明显凋亡发生；TUNEL染色也观察到凋亡的发生，且凋亡发生和药物浓度、作用时间呈依赖关系；流式细胞技术证实EGCG诱导A375细胞的早期凋亡显示出明显的时间和剂量依赖关系；DNA电泳亦可观察到细胞发生凋亡的典型DNA ladder。结论EGCG对黑色素瘤A375细胞的抑制作用与诱导肿瘤细胞的凋亡有关，为进一步研究EGCG的诱导肿瘤细胞凋亡机制奠定了基础。第三部分Survivin、PEDF在EGCG诱导A375细胞凋亡中的作用目的体外观察EGCG诱导黑色素瘤细胞凋亡过程中凋亡相关蛋白Survivin、PEDF的表达变化及其与EGCG的增殖抑制、凋亡诱导的关系，为更深入地研究EGCG的凋亡调控机制奠定基础。方法对人黑色素瘤细胞株A375进行培养传代；运用细胞免疫组化法检测不同浓度EGCG作用肿瘤细胞后Survivin、PEDF蛋白的表达情况；以western-blot法检测不同作用时间EGCG对A375细胞survivin、PEDF蛋白表达的影响；以RT-PCR技术检测不同浓度EGCG对A375细胞survivin、PEDFmRNA表达的影响；同时采用Caspase-3活性检测试剂盒检测不同浓度EGCG作用肿瘤细胞不同时间后的Caspase-3活性。结果免疫组化法观测EGCG作用A375细胞后，Survivin蛋白的表达明显减弱，PEDF蛋白的表达则明显增强，且药物浓度越高，变化越明显；免疫印迹法检测显示Survivin、PEDF蛋白表达的变化与药物作用时间呈一定的依赖关系；RT-PCR检测发现Survivin mRNA表达水平随着EGCG作用浓度的增加而下降，PEDF mRNA表达水平则随着EGCG作用浓度的增加而增加，Survivin cDNA／β-actin cDNA比值与细胞增殖抑制率和细胞凋亡率呈负相关（P＜0.01），PEDF／β-actin cDNA比值与细胞增殖抑制率和细胞凋亡率呈正相关（P＜0.01）；Caspase-3活性检测显示Caspase-3的活性变化和药物浓度、作用时间呈依赖关系，且与Survivin的表达下调、PEDF的表达上调呈平行关系。结论EGCG可通过线粒体途径（caspase-3）来诱导A375细胞凋亡，Survivin、PEDF可通过与caspase-3的相互作用发挥其抑制／促进凋亡功能，EGCG通过线粒体途径诱导A375细胞的凋亡可能是通过调节凋亡相关基因Survivin、PEDF的表达来实现。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 材料
• 一、细胞株
• 二、药物
• 三、主要试剂及酶类
• 主要仪器和器材
• 第一部分 Survivin、PEDF在皮肤恶性黑色素瘤组织中的表达及临床意义
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 EGCG对恶性黑色素瘤A375细胞生物学行为的影响
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Survivin、PEDF在EGCG诱导恶性黑色素瘤A375细胞凋亡中的作用
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 攻读博士学位期间发表的主要论文
• 致谢