论文摘要
芳香族氨基酸包括苯丙氨酸（L-phe）、酪氨酸（L-tyr）和色氨酸（L-trp）,是生物体内非常重要的必需氨基酸,具有重要的生物学功能,广泛应用于医药、食品和饲料等领域。目前以廉价糖质为原料的微生物发酵法已在氨基酸工业生产中得到了广泛应用,具有经济,环境友好的特点,但由于芳香族氨基酸微生物发酵法菌种来源困难,生物代谢途径长而复杂,无论从自然界中筛选获得具有产酸能力的菌株,建立其发酵条件,乃至采用经典的物理化学诱变,都难以获得可供工业生产的高活力的产芳香族氨基酸的菌株。随着现代生物技术的发展,应用生物化学与分子生物学方法,通过分子进化,特别是代谢工程作为一门学科的诞生和向系统学科的发展,重新合理设计并改造大肠杆菌的生物代谢途径,达到定向合成目的代谢产物,以构建高产的基因工程菌株,成为现代生物技术研究的一个新热点。本研究在建立芳香族氨基酸高通量分析测定方法的基础上,从其代谢途径及其代谢调控着手,利用分子生物学技术手段,通过关键基因的改造与重组,增加芳香族氨基酸生物合成途径中的代谢流,为构建目标产物-色氨酸基因工程菌打下基础,主要完成了以下工作:1.对大肠杆菌的中心代谢途径进行了改造以提高芳香族氨基酸生物合成前体物PEP和E4P的浓度。由于ppsA基因和tktA基因对芳香族氨基酸生物合成前体物PEP和E4P合成起关键作用,本文首先在pZE12质粒上分别克隆了ppsA和tktA基因。在此基础上,设计引物,分别以pZE12-ppsA和pZE12-tktA为模板,PCR扩增,得到带有各自启动子和终止子的PLlacO-1-ppsA-T1和PLlacO-1-tktA-T1片段,并将这两个基因在pZA31质粒上共表达。与对照相比,PEP合成酶（ppsA编码）和转酮酶酶活（tktA编码）分别升高3倍和3.5倍2.对大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成共同途径和分支途径进行改造以进一步打通芳香族氨基酸生物合成通路。为此,利用RED重组系统敲除trpR基因以解除芳香族氨基酸合成通路中关键酶基因受到的反馈阻遏调控作用,然后又进一步敲除TnaA基因以截断细胞内色氨酸分解代谢。菌落PCR结果表明,基因双敲菌构建成功。结果还显示,采用RED重组系统基因敲除时,敲除效率与同源序列长度有关,序列越长,敲除效率越高。此外,由于使用的质粒pZE12和pZA31的启动子分别是PLlacO-1和PLtetO-1,诱导表达需要lacR和tetR参与。本文利用P1噬菌体转导方法将BWRI基因组上的lacR-Spr-tetR基因分别转移到trpR基因敲除菌以及trpR和tnaA双基因敲除菌的基因组上。并将基因组上整合lacR和tetR基因,同时缺失trpR基因的工程菌命名为MGΔR-RI;将基因组上整合lacR和tetR基因,同时缺失trpR和tnaA基因的工程菌命名为MGΔRT-RI。与此同时,还通过共表达抗反馈抑制的aroG和trpED基因以去除芳香族氨基酸合成通路中共同途径及分支途径的瓶颈。在分别构建pZE12-aroGfbr和pZE12-trpEDfbr重组质粒的基础上,使aroGfbr和trpEDfbr这两个基因在pZE12上串联表达。在克隆aroGfbr时,采用了LIC（ligation independent cloning）的方法。在pZE12上串联表达aroGfbr和trpEDfbr这两个基因时,以pZE12-aroGfbr和pZE12-trpEDfbr为模板,PCR扩增pZE12-aroGfbr整个质粒和PLlacO-1-trpEDfbr-T1片段,连接两段PCR产物,使aroGfbr和trpEDfbr这两个基因在pZE12上串联表达,结果:aroGfbr和trpEDfbr共表达后,与对照相比,DAHP合成酶（aroG编码）和邻氨基苯甲酸合成酶（trpED编码）活性分别提高了4.3倍和7倍。3.对工程菌pZA31-ppsA-tktA & pZE12-aroGfbr-trpEDfbr/MG1655ΔRT-RI进行实验室摇瓶发酵实验。首先根据工程菌在不同培养基中的生长状况,确定了适合工程菌发酵的培养基,然后采用正交实验设计方法,研究了发酵瓶装量,糖浓度以及诱导剂浓度三个试验因素对工程菌生长以及色氨酸产量的影响,确定了工程菌发酵的最优条件为发酵瓶装量为100ml、葡萄糖浓度为1%、诱导剂IPTG浓度为0.5mM,为下一步利用发酵罐发酵工程菌打下了基础。最优发酵条件下,工程菌色氨酸产量达到1.3g·L-1。4.上述结果显示,经过一系列改造并经发酵条件优化后,工程菌色氨酸产量升高尚不够显著。综合文献报道,分析其原因,可能是基因之间表达水平尚不平衡而导致中间代谢产物积累,影响细菌生理状态及产物量的提高。因此,我们又以以trpR单敲菌MG1655ΔR-RI为宿主,利用大肠杆菌细胞小RNA的突变体微调关键基因aroGfbr和trpEDfbr表达,并研究了微调关键基因表达对工程菌色氨酸产量的影响。cr-sodB1和cr-sodB2分别与aroGfbr和trpEDfbr融合并置于各自的启动子PLlacO-1之后在pZE12上串联表达,而将RhyB1置于pZA31质粒上的PLtetO-1启动子之后。加入诱导剂aTC和IPTG,诱导表达后,由于RhyB1分别和cr-sodB1-aroGfbr以及cr-sodB2-trpEDfbrmRNA 5′端的cr-sodB区域结合,并且RhyB1与cr-sodB1和cr-sodB2的结合强度不同,导致aroGfbr和trpEDfbr以不同速度降解,因此,aroGfbr和trpEDfbr两个基因表达水平受到不同程度的调控。结果表明:与对照相比,采用小RNA微调可以使trpED和aroG mRNA水平和酶活出现了不同程度的下降,而工程菌pZA31-rhyB1&pZE12-cr-sodB1-aroGfbr-cr-sodB2-trpEDfbr/MG1655ΔR-RI色氨酸产量却上升了56%。总之,本文对大肠杆菌整个芳香族氨基酸合成通路进行了改造,构建了色氨酸基因工程菌pZA31-ppsA-tktA & pZE12-aroGfbr-trpEDfbr/MG1655ΔRT-RI,并经过发酵条件的优化,工程菌色氨酸产量达到1.3g·L-1。与此同时,本文还以trpR单敲菌MG1655ΔR-RI为宿主,研究了大肠杆菌细胞小RNA的突变体微调aroGfbr和trpEDfbr表达对工程菌色氨酸产量的影响。采用小RNA微调可以使trpED和aroG mRNA水平和酶活出现了不同程度的下降,而工程菌色氨酸产量却上升了56%。说明关键基因的平衡协调表达有助于工程菌目标产物产量的提高,小RNA能够被用于微调基因表达水平。验证了基因之间表达水平不平衡影响产量提高的推论。为进一步利用转录后调控机制,调控芳香族氨基酸代谢通路中其他关键基因的表达水平,为构建高产的基因工程菌打下基础。