单宁酸对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其抑制聚（ADP-核糖）聚合酶激活机制的研究

论文摘要

随着人们生活水平的提高,不论是欧美发达国家,还是包括我国在内的发展中国家,糖尿病（DM）的患病率都呈逐年增高趋势,目前,全球DM患者已超过1.5亿。糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是DM微血管病变所导致的肾小球病变,被称为DM肾小球硬化症,是最严重、最常见的DM并发症之一,主要病理特征为肾小球肥大、肾小球基膜增厚和细胞外基质（ECM）积聚。DN已成为引起终末期肾脏疾病的主要原因,严重威胁人类的健康。目前,DN的发病机制尚未完全阐明,且缺乏有效的防治措施来控制DN的发生发展。单宁酸（GLTN）又称鞣酸或鞣质,广泛存在于植物界,约70%中草药中含有此类化合物。GLTN具有多种生物学活性,如抗氧化、抗炎、降脂降糖及延缓衰老等。已有的研究表明,GLTN具有降低血糖及降低慢性肾衰竭大鼠血肌酐和尿素氮的作用,GLTN处理能明显减轻顺铂引起的大鼠肾脏损伤程度,提示GLTN对不同原因导致的肾脏损伤均有较好的防治作用。然而.有关GLTN对DN发生发展的影响及其分子机制尚未阐明。聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）为蛋白质翻译后主要修饰酶之一,参与细胞许多重要活动过程。作为重要的应激蛋白,PARP过度激活可使NAD‘和ATP耗竭,并对某些细胞因子及转录调节因子发挥调节作用,引起细胞病变。PARP1是PARP家族中最重要的成员,大约占细胞内PARP活性的900％上。大量研究表明,PARP1激活在DN发生发展中起重要作用,PARP1过度激活可在聚ADP核糖（PAR）核糖基化过程中耗竭NAD+和ATP、减慢糖酵解速率以及上调内皮素-1（ET-1）、肿瘤坏死因子-a（TNF-α）,一氧化氮合酶（NOS）等因子表达,导致细胞功能损害或细胞死亡,诱发DN。抑制PARP1活性在某些疾病中的治疗价值已引起研究人员的关注。目前认为有两种方式能防止PARP1过度激活,一是使用PARP抑制剂,如3-AB、PJ34等：二是抑制聚（ADP-核糖）水解酶（PARG）活性。因PARG是降解PAR的酶,可阻止聚ADP核糖链的裂解,因而间接抑制PARP激活。目前应用于实验研究的PARP抑制剂,如3-AB、PJ34和1,5-异喹啉二醇等均属化学试剂,对人体的毒副作用尚未确定。GLTN是PARG的抑制剂,GLTN作为某些中药的有效成分已在临床应用多年,故以GLTN作为PARP的间接抑制剂,可能更具有实用性应用前景。本研究以STZ诱发DM大鼠的肾脏及大鼠肾小球系膜细胞（GMC）为研究对象,主要研究以下问题：①GLTN对DM大鼠血糖、肾脏功能、形态及肾脏8-OHdG、3-NT水平的影响：②DM大鼠肾脏和高糖培养GMC中PARP1、PARG含量变化及二者间的关系；③GLTN对DM大鼠肾脏及高糖培养GMC中PARP1、PARG活性的影响：④PARP1及PARG活性对肾ECM合成代谢（ColⅣ、FN）和分解代谢（PAI-1、TIMP-2）的影响及GLTN的改善作用；⑤PARP1、PARG活性与细胞因子（TGF-β1、CTGF）之间的关系：⑥GLTN对DM大鼠肾脏及高糖培养GMC中TGF-β1及CTGF表达的影响。本研究旨在从分子水平探讨GLTN对DM肾脏病变的影响及可能的机制,为临床DN的防治提供实验资料。本研究的主要结果如下：1.DM大鼠给予GLTN处理后,能明显降低血糖水平,降低血肌酐、血尿素氮和24 h尿蛋白排泄量,并改善肾脏病变程度。2.与对照大鼠相比,DM大鼠肾脏8-OhdG及3-NT水平显著提高,GLTN处理的DM大鼠肾脏8-OhdG及3-NT水平显著下降。3.DM大鼠肾脏PARP1及PARG蛋白表达显著高于正常对照大鼠（P<0.01）,且二者的表达水平呈正相关（,r=0.927.P<0.01）：GLTN可抑制DM大鼠肾脏PARG蛋白表达,在抑制PARG的同时对PARP1表达也具有抑制作用。4.DM大鼠肾脏PARP1与TGF-β1蛋白表达量呈正相关（r=0.899,P<0.01）,GLTN处理可下调PARP1、PARG、TGF-β1 CTGF mRNA及蛋白表达水平。5. GLTN处理可有效降低DM大鼠肾脏ColⅣ、FN、PAI-1和TIMP-2蛋白表达水平（ P<0.01 ）,从而抑制ECM合成,促进ECM降解,减少ECM积聚。6. GLTN可明显降低高糖培养GMC的S期百分比（P<0.01）,抑制GMC增殖,这种抑制作用呈现一定时间和浓度依赖关系。7. GLTN可降低高糖培养GMC上清中ColⅣ、FN、PAI-1和TIMP-2含量（P<0.01）,且呈浓度-效应依赖关系。8.高糖培养GMC PARP1及PARG的表达水平随作用时间的延长而增强,呈现时间依赖效应：GLTN处理对上述两指标均有抑制作用,并呈时间及浓度依赖关系,GLTN在40μmol/L浓度及作用24 h时效果最佳。9. GLTN处理可下调高糖培养GMC PARPl、PARG、TGF-β1 CTGF mRNA及蛋白的表达水平（P<0.01）：PARP1与TGF-β1表达呈正相关（r=0.892,P<0.01）)。本研究的主要结论是：1. GLTN处理可明显降低DM大鼠血糖水平,改善肾功能和肾脏病变程度,降低DM大鼠肾组织8-OhdG及3-NT水平2. GLTN通过抑制DM大鼠肾脏PARG激活对PARP1发挥抑制作用：GLTN抑制DM大鼠’肾组织PARP1的同时可下调TGF-β1表达，延缓DN病变发展。3.体内外研究结果证明,GLTN可从抑制ECM合成和促进降解两个方面减少ECM积聚。4. GLTN可抑制高糖培养GMC增殖：高糖培养GMC中PARP1及PARG基因及蛋白表达水平均增高,GLTN可抑制其表达上调。5.高糖培养GMC中PARP1与PARG表达水平呈正相关；PARP1与TGF-β1表达水平呈正相关。本研究的主要创新点：证明STZ诱发的DM大鼠肾脏及高糖培养GMC中PARP1与PARG表达水平均上调且二者呈正相关,GLTN通过防止PARG激活间接抑制PARP1活性,发挥肾脏保护作用；DM大鼠肾脏及高糖培养GMC中PARP1与TGF-β1表达呈正相关；GLTN下调ColⅣ、FN表达减少ECM合成,降低PAI-1、TIMP-2水平促进ECM降解,从两个方面减少ECM积聚。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第1章 前言
• 第2章 文献综述
• 2.1 DN发病机制
• 2.1.1 氧化应激与DN
• 2.1.2 细胞因子与DN
• 2.2 聚（ADP-核糖）聚合酶
• 2.2.1 PARP1结构及PARP家族
• 2.2.2 PARP的生物学活性
• 2.2.3 PARP与DN
• 2.3 单宁酸
• 2.3.1 理化性质
• 2.3.2 生物学活性
• 2.3.3 药理作用及应用
• 2.3.4 单宁酸与PARG
• 2.3.5 单宁酸与DN
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物与细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 体内实验
• 3.2.2 体外实验
• 3.2.3 统计学处理
• 第4章 结果
• 4.1 体内实验
• 4.1.1 一般状态及模型复制
• 4.1.2 GLTN对各组大鼠肾脏指数的影响
• 4.1.3 大鼠血糖动态变化
• 4.1.4 GLTN对各组大鼠肾功能的影响
• 4.1.5 肾脏形态学检查
• 4.1.6 ELISA检测结果
• 4.1.7 免疫组化染色结果
• 4.1.8 RT-PCR检测结果
• 4.1.9 Western blot检测结果
• 4.2 体外实验
• 4.2.1 GLTN抑制GMC增殖的浓度依赖效应与时间效应
• 4.2.2 GLTN对GMC细胞周期的影响
• 4.2.3 ELISA检测结果
• 4.2.4 免疫组化检测GMC TGF-β1和CTGF蛋白表达
• 4.2.5 免疫荧光检测GMC PARP1和PARG蛋白含量
• 4.2.6 逆转录PCR检测结果
• 4.2.7 Western blot检测结果
• 第5章 讨论
• 5.1 GLTN对实验性DM大鼠血糖及肾脏结构与功能的影响
• 5.2 GLTN对DM大鼠肾组织PARP1及PARG活性的影响
• 5.3 GLTN对DM大鼠氧化应激及硝化应激的影响
• 5.4 GLTN对DM大鼠肾组织细胞因子的影响
• 5.5 GLTN对ECM生成和降解的影响
• 5.6 GLTN对GMC增殖及细胞周期的影响
• 5.7 GLTN对GMC PARP1、PARG活性的影响及与TGF-B1的相关性
• 小结
• 第6章 结论
• 参考文献
• 附图
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢