论文摘要
研究背景:蚊媒可传播多种疾病,如:疟疾（malaria）、流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis B）、丝虫病（filariasis）、登革热（dengue fever）等,是严重威胁人民生命健康的重要疾病。一些蚊媒病如登革热的发病率呈逐年递增的趋势并常有局部暴发流行。疟疾是世界上感染率最高,死亡人数最多的疾病之一。每年有超过30亿人受到疟疾的威胁,死亡人数达200余万。造成这种严重局面的最主要原因是缺乏预防疟疾的有效措施以及蚊媒和病原不断产生耐药性。因此探索并开发新的防治蚊媒疾病的措施已成为当前迫切需要解决的问题,控制昆虫媒介再次成为最有效且实用的抗疟手段。疟原虫是人体疟疾的病原体,共有四种类型,在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫。人体疟原虫需要人和雌性按蚊做宿主,它在蚊体内的发育包括在蚊胃腔内进行有性生殖即配子生殖（gametogony）和在蚊胃壁进行的无性生殖即孢子增殖（sporogony）两个阶段。子孢子是疟原虫感染人体的阶段。恶性疟原虫环子孢子蛋白（Circumsporozoite protein,CSP）覆盖于子孢子表面,是其重要保护性抗原及粘附入侵靶细胞的物质基础。恶性疟CSP的鼠源单克隆抗体2A10在体外能够阻止子孢子进入蚊唾液腺和人肝细胞。2A10scFv（Single-chainFV antibody fragment）是2A10单链抗体可变区片段。在以鼠源性2A10scFv为靶基因的转基因蚊中,蚊体内所表达的2A10scFv能够与子孢子结合,从而阻断其钻入唾液腺。但由于蛋白的表达量不高,因此未能达到完全阻断子孢子入侵的效果。近年来,国际上提出了利用转基因技术对蚊媒进行遗传修饰以控制蚊媒疾病的新策略。外源基因在转基因蚊体内的表达对于转基因蚊的抗病原效应至关重要,它受到启动子、插入部位及外源基因本身特性等诸多因素的影响。其中,外源基因的密码子在宿主蚊体内的使用频率,即遗传密码子的偏嗜性被认为是一个重要影响因素。物种间编码同一氨基酸的不同密码子的使用频率存在差别,一些在外源基因中出现的密码子很少为表达宿主所使用,相对应的tRNA在宿主体内稀少,由此影响了外源基因mRNA的翻译过程,从而降低了效应蛋白的表达量。在对于大肠杆菌偏嗜性人胰岛素样生长因子1的研究中,实验人员依据大肠杆菌遗传密码子使用频率表,人工合成3条DNA单链,PCR拼接扩增出适于在大肠杆菌中表达的人IGF-1基因。所构建的大肠杆菌偏嗜性人IGF-1基因可显著提高rhIGF-1的产率。此外将异源的免疫原基因密码子优化为免疫接种动物偏嗜性密码子能够提高抗原表达效率并改进DNA疫苗免疫效果也已被许多研究所证实。本实验中经对比分析,鼠源性2A10scFv基因中有些密码子在蚊体内的使用频率确实很低,例如,编码丝氨酸的密码子UCU在冈比亚按蚊的使用频率仅为4.1%。那么我们能否通过2A10scFv基因密码子的蚊偏嗜性改造,使其更适于在转基因蚊体内表达从而提高其表达量、增加其稳定性及生物学活性呢?抗菌肽（antimicrobial peptides,AMP）是抗菌活性短肽的总称。目前已发现抗菌肽或类似的小分子肽类广泛存在于生物界,包括细菌、动植物和人类。内源性的抗菌肽经诱导合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用,被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。例如,Reed等将Shiva-Ia转入小鼠中,转基因小鼠对布鲁氏杆菌的抵抗力显著增强;Possani等的研究表明,在蚊体内表达Shiva-3可以抑制疟疾的传播。与传统抗生素相比,某些抗菌肽的抗菌活性还不够理想,改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其产量及活性的有效途径。例如,Christsnen B等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一个供体抗菌肽的活性都高;Durasula等通过在长红猎蟋的共生菌中表达Cecropin A显减少了其体内锥虫的数量。Cecropins是第一个被发现的动物抗菌肽,1975年瑞典科学家从惜古比天蚕（Hyatophoracecropia）蛹中诱导分离得到。其中Cecropin A对各种大肠杆菌和其他革兰氏阴性菌如沙门氏菌具有很强的活性,对部分革兰氏阳性菌也具有一定的杀伤活性。其作用机理不同于传统抗生素,不会导致抗药菌株的产生,且对正常的真核生物细胞及霉菌不起作用。由于抗菌肽的分子小,对蛋白酶非常敏感,因此很难直接大量表达而多采用融合表达策略以降低其对宿主细胞的毒性。综上,能否通过基因融合配伍增强Cecropin A及2A10scFv的抗病原作用及Cecrop-m2A10在蚊体内的稳定性呢?目的:1.对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2A10基因进行改造,构建融合基因Cecrop-m2A10。2.原核表达Cecrop-m2A10基因,并对其表达产物进行生物学活性分析。3.构建以蚊眼特异性启动子（3xP3）驱动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标志物,Vg启动子驱动Cecrop-m2A10序列及高度特异性转座元件piggyBac组成的具有完整调控元件的重组转基因载体质粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。方法:1.根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2A10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽Cecropin A编码基因,构建融合基因Cecrop-m2A10及重组质粒pBSK（+）-Cecrop-m2A10。2.用PCR方法以pBSK（+）-Cecrop-m2A10为模板克隆Cecrop-m2A10基因,构建表达重组质粒pET32a（+）-Cecrop-m2A10,并对重组质粒进行测序鉴定。3.将重组质粒pET32a（+）-Cecrop-m2A10转入BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达。4.优化工程菌pET32a（+）-Cecrop-m2A10的表达条件,大量诱导表达后对重组蛋白进行纯化。5.Western blotting鉴定重组表达蛋白。6.采用琼脂糖扩散法检测融合蛋白的体外抑菌活性。7.运用分子克隆技术,以pBSK（+）-Cecrop-m2A10及pSLfall80fa-AsVg-CFP-3’VTR载体质粒为基础质粒,构建以蚊眼特异性启动子（3xP3）驱动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标志物,Vg启动子驱动Cecrop-m2A10序列及高度特异性转座元件piggyBac组成的具有完整调控元件的重组转基因载体质粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。结果:1.对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2A10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造并融合Cecropin A编码基因,全基因合成法获得融合基因Cecrop-m2A10。并成功构建重组质粒pBSK（+）-Cecrop-m2A10。2.成功构建表达重组质粒pE/32a（+）-Cecrop-m2A10,测序结果显示读码框架正确。通过IPTG诱导得到以包涵体形式高效表达的重组蛋白。包涵体经过尿素洗涤,变性,透析复性后纯度达83.7%。Western blotting分析显示重组蛋白与抗6-His抗体可产生59KD大小的特异性反应条带。3.琼脂糖扩散法结果显示,纯化的重组蛋白具备抗大肠杆菌DH5α的活性。4.成功构建了以蚊眼特异性启动子（3xP3）驱动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标志物,Vg启动子驱动Cecrop-m2A10序列及高度特异性转座元件piggyBac组成的具有完整调控元件的重组转基因载体质粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。结论:1.成功构建融合基因Cecrop-m2h10。2.成功构建表达重组质粒pET32a（+）-Cecrop-m2A10。在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,纯化后纯度达83.7%。3.初步鉴定显示纯化的重组蛋白具备抗大肠杆菌DH5α的活性。4.构建了以蚊眼特异性启动子（3xP3）驱动的红色荧光蛋白（DsRed）作为筛选标志物,Vg启动子驱动Cecrop-m2A10序列及高度特异性转座元件piggyBac组成的具有完整调控元件的重组转基因载体质粒pBac-AsVg-Cecrop-m2A10。
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相关论文文献
- [1].恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析[J]. 寄生虫与医学昆虫学报 2008(01)