论文摘要
目的STGC3基因是新近克隆的鼻咽癌相关候选抑癌基因,定点突变该基因的三个可能性功能位点,分别构建三个单碱基定点突变的重组真核表达载体,突变重组真核表达载体转染鼻咽癌CNE2细胞系,通过该基因不同突变体表达对CNE2细胞系生长增殖的影响,分析STGC3基因发挥抑瘤作用的可能性功能位点。方法生物信息学分析显示,STGC3基因含有一个糖基化位点,一个蛋白激酶C磷酸化位点,一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,针对上述三个可能性功能位点,设计定点突变引物,在基因的5’端加上Kozak序列,增强基因的转录活性。运用重叠延伸PCR、MutanBEST和Stratagene三种定点突变技术,对STGC3基因C656G,C725T,T913G三个位点的单碱基进行诱导定点突变,使编码的STGC3蛋白质糖基化位点43位丝氨酸突变为半胱氨酸,蛋白激酶C磷酸化位点66位丝氨酸突变为苯丙氨酸,酪氮酸激酶Ⅱ磷酸化位点129位丝氨酸突变为丙氨酸。所构建多个重组真核表达载体,经双酶切和测序鉴定,证实多个pcDNA3.1TM/myc-His B-STGC3基因的突变载体构建成功。重组真核表达载体经脂质体转染CNE2细胞系,G418筛选,分别建立稳定表达野生型和突变型STGC3基因的CNE2细胞系,细胞系采用RT-PCR、Western Blotting和免疫细胞化学方法,从mRNA和蛋白质表达水平,检测STGC3基因的表达,采用MTT、胎盼蓝染色细胞计数、平皿克隆集落形成及流式细胞仪分析,研究分析STGC3基因突变对CNE2细胞生长增殖速度、克隆形成率、细胞周期分布及凋亡的影响,分析STGC3基因的可能性功能位点。结果成功构建一个野生型和三个突变型pcDNA3.1TM/myc-His B-STGC3重组真核表达载体。免疫细胞化学检测结果显示,野生型与突变型STGC3蛋白质表达,见于胞浆和胞核。生长曲线绘制和平皿克隆形成实验结果表明,STGC3基因C656G,C725T点突变,均可导致其对CNE2细胞生长抑制作用减弱。流式细胞仪检测结果表明,转STGC3基因C656G,C725T点突变载体CNE2细胞系与未转染CNE2细胞的凋亡率相似,差异无显著性（P＞0.05）。而转染T913G点突变STGC3基因CNE2细胞系与转野生型STGC3基因CNE2细胞系相比较,细胞的生长速度及凋亡率相似（P＞0.05）,但明显高于未转染组、转空载体组、C656G和C725T点突变基因组（P＜0.05）。研究结果表明,656C和725C可能是STGC3基因发挥抑瘤功能的关踺性位点,而913T的改变可能不影响STGC3基因的细胞生长负调控作用。流式细胞仪检测结果显示,STGC3基因的上述三个位点突变,对转染CNE2细胞周期无明显影响（P＞0.05）。结论1、重新恢复STGC3基因在CNE2细胞系的高表达,可抑制CNE2细胞系生长增殖,并促进其凋亡。2、STGC3基因656位的C和725位的C,是该基因发挥抑瘤功能的关键性位点。3、STGC3基因913位的T突变,不影响STGC3基因的细胞生长负调控作用。