结核杆菌主要耐药基因检测芯片的制备

论文摘要

目的:用寡核苷酸基因芯片的技术方法,检测结核杆菌耐药基因的热点突变,为结核病的耐药性诊断探索快速、准确的基因检测途径与方法。方法与结果:第一部分:结核杆菌检测基因芯片靶基因克隆及鉴定本试验研究采用了直接测序的方法对临床耐药结核分枝杆菌菌株的耐药相关基因进行分析,检测了结核杆菌的常见耐药基因。1.收集一定数量且有代表意义的结核杆菌耐药株,共提取了34株结核杆菌的基因组DNA。2.在gene bank中检索结核杆菌耐药基因的DNA序列后,设计并合成靶基因引物序列。3.采用PCR扩增靶基因获得7个靶基因片段,用pMD18-T克隆和筛选获得了靶基因重组质粒,并通过PCR与酶切鉴定。4.多重序列比对和Blast分析进一步表明:克隆鉴定的靶基因为目标病原的高度保守性基因,为结核杆菌检测基因芯片的构建提供了确实可靠的材料。第二部分:结核杆菌检测基因芯片的构建本试验研究了结核杆菌检测基因芯片靶基因和探针制备方法、靶基因杂交温度和特异性,确定了构建检测芯片的靶基因及其浓度和有关芯片质量控制方法。1.靶基因和定位对照基因的制备以靶基因重组质粒DNA为模板,采用PCR扩增、异丙醇沉淀法纯化靶基因,用荧光素Cy3标记的引物对其再次进行Exon 21、Exon22的PCR扩增,其浓度和纯度符合芯片制作要求。2.根据靶基因常见突变点的情况设计并合成寡核苷酸探针,5`氨基标记,制备的探针浓度在121-748ng/μL之间。3.将探针按一定的顺序点样于醛基化的基片上,制备成基因芯片。4.用带有荧光标记的靶基因样本与基因芯片进行杂交,显像,分析并确定结果。5.本试验确定了靶基因最适点样浓度为300ng/μL,芯片系统灵敏度为3pg/μL探针,筛选出杂交信号强、杂交特异性好的靶基因及其杂交温度,确定了预杂交时间为1h和杂交时间为5h。结论:本实验所制备的基因芯片可用于检测结核分枝杆菌耐药性,且具有较高的特异性和敏感性,可用于临床结核杆菌耐药性的检测。并具有快速、简便、敏感的特点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 结核分支杆菌耐药性分子机制的研究进展
• 1.1 结核杆菌对异烟肼的耐药机制
• 1.2 结核杆菌对链霉素的耐药机制
• 1.3 结核杆菌对利福平的耐药机制
• 1.4 结核杆菌对吡嗪酰胺的耐药机制
• 1.5 结核杆菌对乙胺丁醇的耐药机制
• 1.6 结核杆菌对氟喹诺酮类的耐药机制
• 2 结核杆菌突变检测的方法及进展
• 2.1 表型检测
• 2.2 基因检测
• 2.3 其他
• 3 基因芯片的研究进展
• 3.1 基因芯片的基本概念
• 3.2 基因芯片的发展之路
• 3.3 基因芯片的类型
• 3.4 基因芯片技术的主要流程
• 3.5 基因芯片存在的问题及解决的策略
• 第二章 实验与研究内容
• 实验一 结核杆菌检测基因芯片靶基因克隆及鉴定
• 1 材料、试剂与仪器
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 结核杆菌对药物的敏感性
• 4.2 结核杆菌主要耐药基因PCR扩增
• 4.3 靶基因的克隆和鉴定
• 4.4 结核杆菌主要耐药基因测序结果
• 实验二 结核杆菌检测基因芯片的构建
• 1 材料、试剂与仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 4.1 寡核苷酸探针的设计及其优点
• 4.2 荧光样品的制备
• 4.3 芯片基片的处理
• 4.4 寡核苷酸芯片的点样
• 4.5 点样探针的浓度
• 4.6 点样的方法
• 4.7 点样的后处理
• 4.8 杂交
• 4.9 杂交温度、杂交时间的优化
• 4.10 杂交后清洗温度及时间
• 4.11 靶基因的交叉杂交
• 4.12 杂交结果判定
• 结论
• 参考文献
• 附表
• 致谢
• 作者简介