论文摘要
选择蛋白家族是细胞黏附分子家族成员之一,包括E-、P-、L-选择蛋白三个成员。分别表达在不同的组织器官,发挥不同的生物学作用。其中P-selectin（CD62p、GMP140）是急性炎症早期介导炎症细胞向受损部位趋集的重要因素。其可介导中性粒细胞、单核细胞等与血小板,内皮细胞的黏附作用。与免疫损伤、炎症反应、血栓形成及肿瘤转移等密切相关。P-选择蛋白基因位于1号染色体,不同种系间有高度同源性。P-selectin是一种分子量为140kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,定位于血小板的α颗粒和内皮细胞棒管状小体内。全长由789个氨基酸残基组成。P-选择蛋白分子从N末端到C末端由五部分组成,分别是:钙离子依赖性凝集素样域（lectin）,又称糖识结构域（carbohydrate recognition domain,CRD）、表皮生长因子样结构域（epidermal growth factor-like domain EGF结构域）、9个较短的重复序列（short consensus repeat SCR结构域）,又称补体调节蛋白结构域、最后是跨膜区和短的胞质内尾巴。其中凝集素样结构域和表皮生长因子结构域与其生物学功能密切相关。P-选择蛋白的最重要配体是PSGL-1,它是一种富含O-、N-连接糖链的蛋白质二聚体,它在很多成熟白细胞表面都有表达,如中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、以及一些前体细胞。其功能是介导细胞间的黏附。它的结构功能已经被详细的研究。通过大量对人类及小鼠体内实验研究表明P-选择蛋白与其配体PSGL-1在血小板与白细胞间的相互作用,以及白细胞在内皮细胞表面上滚动起到重要作用,进而引起内皮细胞内的信号转导。实验目的是将人类P-选择蛋白的胞外结构域基因与Sig分泌信号肽基因共同插入到真核表达载体pcDNA3.1中,在真核瞬时表达载体293T细胞中表达,并纯化、鉴定表达产物,为进一步研究P-选择蛋白的功能提供有生物活性的蛋白。实验方法:通过PCR的方法从已知的P-selectin/IgG融合表达载体pcDNA1（由Dr.Fukuda MN惠赠）获取P-selectin的胞外结构域基因,通过TA亚克隆将胞外结构域基因插入pMD-18T载体中,经HindⅢ,AatII双酶切鉴定后进行测序。测序正确后将胞外结构域基因插入pX载体（pX载体在AatII, HindⅢ酶切位点上游连有IgG的分泌性信号肽）中,再通过酶切的方法从pX载体中获取目的融合基因,最后将目的融合基因插入pcDNA3.1表达载体中获得表达载体。将构建好的表达载体通过氯化钙法转化到DH5α菌中。提取超纯去内毒素质粒,用脂质体转染试剂将其转染至293T细胞中。继续培养转染后的293T细胞,回收细胞培养上清,利用组氨酸亲和层析柱对培养上清中的融合蛋白进行纯化,用SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定目的蛋白,进而通过体外黏附试验观察其对HL-60细胞的黏附能力。实验结果:用NotⅠ,HindⅢ酶切及PCR方法对最后构建好的表达载体鉴定,1%琼脂糖电泳结果显示,720bp和处650bp处片断大小与预期一致。将表达载体送到报生物公司测序,测序结果与我们所要的基因片断完全符合。将重组的pcDNA3.1表达载体转染到293T细胞后的24小时开始表达蛋白,将细胞放置5天后收集上清,经Ni柱亲和层析纯化后,在SDS-PAGE图谱上出现一条分子量约40kD的蛋白条带,与预期蛋白分子量一致;Western-blot分析鉴定目的蛋白能与兔抗c-Myc多克隆抗体特异性结合;体外黏附试验结果表明,该融合蛋白与HL-60（含有P-选择蛋白糖蛋白配体-1）间黏附显著增强（P<0.05与对照组相比具有显著统计学意义）结论:1.重组的含有P-selectin胞外结构域基因的pcDNA3.1表达载体构建成功,通过脂质体转染法,可在293T细胞中成功表达。2.纯化后的人类P-selectin的胞外功能域蛋白具有生物学活性可在体外条件下与特异性配体结合。