论文摘要
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是肠道的慢性非特异性炎症性疾病,病因涉及感染、遗传及免疫等方面因素。近年发现信号转导与转录活化因子（signal transducer and activator of transcription, STAT）家族成员参与了多种细胞因子、生长因子的信号转导,可调控人体炎症反应、免疫反应以及细胞的生长、分化等,其中STAT3越来越多地被认为与炎症反应密切相关。国外研究表明UC患者肠黏膜组织中STAT3表达增加且活化增强,但其发挥作用的机制尚不明确。基础研究证实,STAT3主要是由白细胞介素6 （inteleukin 6, IL-6）家族细胞因子通过活化酪氨酸激酶（Janus tyrosine kinase, JAK）较特异地使其发生磷酸化而被激活,磷酸化活化的STAT3可转移入核发挥调节下游靶基因转录的功能,但STAT3在UC中的活化途径还未有研究。目的:检测UC患者肠黏膜STAT3的表达和活化水平及其与临床特征、病理分级的关系,同时检测IL-6的表达并通过分析IL-6表达量与STAT3、p-STAT3表达量之间的相关性,推测STAT3在溃疡性结肠炎发病中的活化机制。方法:收集2005年9月～2006年8月在我院消化科行结肠镜检查的47例UC患者肠黏膜活检标本,根据Truelove-Witts内镜分级标准分为Ⅰ级8例、Ⅱ级22例、Ⅲ级17例,根据“2000年成都全国炎症性肠病学术会议”制订的溃疡性结肠炎诊断标准按临床分度分为轻度15例、中度23例、重度9例。收集同期在我科行结肠镜检查的13例正常结肠黏膜标本作为对照。应用免疫组织化学方法、Western blot技术检测STAT3、p-STAT3及IL-6蛋白在患者及正常对照者肠黏膜的定位分布及表达量,应用半定量反转录聚合酶链反应（Reverse transcription, RT-PCR）方法检测STAT3、IL-6mRNA在UC患者及正常对照者结肠黏膜的表达水平。结果1临床表现及病理特征47例UC患者中26例主要临床表现为黏液脓血便,14例主要表现为便血,7例仅表现为腹痛。8例有发热表现。结肠镜检查可见正常对照组黏膜光滑,血管纹理清晰,中、重度患者黏膜充血水肿、有糜烂、溃疡形成,上多有脓性或脓血性黏液附着,轻度患者黏膜高度充血水水肿,黏膜呈颗粒感,质脆,易出血,4例黏膜有炎性息肉形成。光学显微镜下发现对照组结肠黏膜腺体排列整齐,隐窝、表面上皮完整,黏膜固有层有少量炎性细胞浸润,UC组结肠黏膜充血、水肿,有糜烂、溃疡形成,黏膜杯状细胞减少或消失,腺体萎缩,肠壁变厚,大量炎性细胞浸润,并可见隐窝脓肿形成,有息肉形成者可见不典型增生及纤维结缔组织形成。2 STAT3及p-STAT3在肠黏膜组织的表达2.1 STAT3及p-STAT3在肠黏膜组织的定位分布免疫组织化学染色显示,STAT3为胞浆着色,在正常黏膜主要表达于黏膜固有层散在分布的单个核细胞,中性粒细胞和黏膜上皮细胞中也可见表达,阳性细胞较少;UC患者黏膜炎性细胞大量浸润,STAT3表达位置与正常黏膜一致,阳性细胞较正常黏膜明显增多且染色较深。p-STAT3主要为胞核着色,胞浆中仅有少量表达,正常黏膜几乎没有p-STAT3阳性细胞或仅极少地表达于黏膜中散在的单个核细胞;在UC患者p-STAT3表达于肠黏膜中大量浸润的单个核细胞中,阳性细胞较正常黏膜明显增多,染色较深。内镜下Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组STAT3表达强度均明显高于正常组（24.88 vs 14.50, 33.75 vs 14.50, 41.18 vs 14.50）,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01,但病例各组之间无明显差异,P>0.05。内镜下Ⅱ级组、Ⅲ级组p-STAT3表达强度均明显高于正常组（34.11 vs 15.00, 42.09 vs 15.00）,P<0.01,Ⅰ级组与正常组无明显差异（21.13 vs 15.00）,P>0.05;Ⅱ级组、Ⅲ级组表达强度均明显高于Ⅰ级组,分别P<0.05,P<0.01;Ⅱ级组与Ⅲ级组之间无明显差异,P>0.05。临床轻度组、中度组、重度组STAT3表达强度均明显高于正常组（28.70 vs 13.50, 35.70 vs 15.00, 44.78 vs 13.50）,P<0.01,重度组明显高于轻度组,P<0.05;轻度组与中度组之间、中度组与重度组之间无明显差异,P>0.05。临床轻度组、中度组、重度组p-STAT3表达强度均明显高于正常对照组（29.00 vs 14.00, 35.96 vs 14.00, 42.89 vs 14.00）,P<0.01,临床重度组分别明显高于轻度组、中度组,P<0.05;轻度组与中度组之间无明显差异,P>0.05。2.2肠黏膜组织STAT3及p-STAT3蛋白的表达变化Western blot分析显示,在大约90 kD位置出现STAT3或p-STAT3特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带。内镜下Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组STAT3蛋白表达量均显著高于正常组（25.19 vs 8.04, 29.89 vs 8.04, 50.97 vs 8.04）,P<0.01;Ⅲ级组表达量明显高于Ⅰ级组和Ⅱ级组,分别P<0.05,P<0.01;Ⅰ级组和Ⅱ级组之间无明显差异,P>0.05。内镜下Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组p-STAT3蛋白表达量均明显高于正常者（17.75 vs 7.00, 33.61 vs 7.00, 50.44 vs 7.00）,P<0.01;Ⅲ级组分别高于Ⅰ级组、Ⅱ级组,Ⅱ级组明显高于Ⅰ级组,P<0.01。临床轻度组、中度组、重度组STAT3及p-STAT3蛋白表达量均明显高于正常组（26.30 vs 8.04, 38.72 vs 8.04, 48.94 vs 8.04）,（21.70 vs 7.00, 42.33 vs 7.00, 48.89 vs 7.00）,P<0.01;二者在中度组、重度组的表达量均明显高于轻度组,P<0.01;中度组与重度组之间无明显差异,P>0.05。2.3肠黏膜组织STAT3 mRNA表达RT-PCR共扩增检测STAT3和内参照β-actin基因表达,在275 bp处均出现了特异性的STAT3基因条带,500 bp处出现了内参照β-actin的特异片段。STAT3电泳条带的光密度扫描显示,内镜Ⅱ级组、Ⅲ级组STAT3 mRNA表达量均明显高于正常对照组（31.16 vs 12.85, 46.03 vs 12.85）,P<0.01;Ⅰ级组与正常对照组无明显差异（18.88 vs 12.85）,P>0.05,Ⅲ级组、Ⅱ级组均明显高于Ⅰ级组,Ⅲ级组明显高于Ⅱ级组,P<0.01。临床轻度组、中度组、重度组STAT3 mRNA表达量均明显高于正常对照组（28.50 vs 12.85, 35.22 vs 12.85, 47.28 vs 12.85）,P<0.01;重度组分别明显高于轻度组及中度组,P<0.05;轻度组与中度组之间无明显差异,P>0.05。3 IL-6在肠黏膜组织的表达3.1 IL-6在肠黏膜组织的定位分布免疫组织化学染色显示,IL-6为胞浆着色,正常肠黏膜有少量单个核细胞有阳性表达;UC患者黏膜IL-6阳性细胞明显增多,染色较深,主要表达于黏膜固有层中大量浸润的单个核细胞及中性粒细胞。内镜下Ⅱ级组、Ⅲ级组IL-6表达强度均明显高于正常对照组（34.50 vs 16.50, 41.21 vs 16.50）,P<0.01;Ⅰ级组与正常对照组无明显差异（19.50 vs 16.50）,P>0.05;Ⅲ级组、Ⅱ级组表达强度明显高于Ⅰ级组,分别P<0.01,P<0.05;Ⅱ级组、Ⅲ级组之间无明显差异,P>0.05。临床轻度组、中度组、重度组IL-6表达阳性强度均明显高于正常对照组（27.00 vs 16.50, 34.63 vs 16.50, 46.00 vs 16.50）,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;重度组明显高于轻度组,P<0.05;轻度组与中度组之间、中度组与重度组之间无明显差异,P>0.05。3.2肠黏膜组织中IL-6蛋白的表达变化Western blot分析显示,在大约26 kD位置出现IL-6特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带。内镜Ⅱ级组、Ⅲ级组IL-6蛋白表达量均显著高于正常对照组（34.98 vs 10.77, 46.44 vs 10.77）,P<0.01;Ⅰ级组与正常对照组无明显差异（16.38 vs 10.77）,P>0.05;Ⅲ级组、Ⅱ级组表达量均明显高于Ⅰ级组;Ⅲ级组明显高于Ⅱ级组,P<0.01。临床轻度组、中度组、重度组IL-6蛋白表达量均明显高于正常对照组（20.20 vs 10.77, 41.02 vs 10.77, 49.28 vs 10.77）,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;中度组与重度组均明显高于轻度组,P<0.01;中度组与重度组之间无明显差异,P>0.05。3.3肠黏膜组织中IL-6 mRNA的表达变化RT-PCR共扩增检测IL-6和内参照β-actin基因表达,在223 bp处均出现了特异性的IL-6基因条带,500 bp处出现了内参照β-actin的特异片段。IL-6电泳条带的光密度扫描显示,内镜下Ⅰ级组、Ⅱ级组、Ⅲ级组IL-6 mRNA表达量均明显高于正常对照组（23.94 vs 11.62, 35.61 vs 11.62, 41.41 vs 11.62）,分别P<0.05,P<0.01,P<0.01;Ⅲ级组、Ⅱ级组均明显高于Ⅰ级组,P<0.05;Ⅱ级组与Ⅲ级组之间无明显差异,P>0.05。临床轻度组、中度组、重度组IL-6 mRNA表达量均明显高于正常对照组（27.07 vs 11.62, 34.22 vs 11.62, 54.00 vs 11.62）,P<0.01;重度组明显高于轻度组及中度组,P<0.01;轻度组与中度组之间无明显差异,P>0.05。4肠黏膜中STAT3表达与IL-6表达的相关性分析Spearman相关分析显示二者在蛋白及mRNA水平表达均呈正相关,r值分别为0.671,0.485,P<0.01。5肠黏膜中p-STAT3表达与IL-6表达的相关性分析Spearman相关分析显示二者在蛋白水平表达呈正相关,r值为0.764,P<0.01。结论1 UC患者肠黏膜中STAT3表达增加,活化增强;且STAT3及p-STAT3的表达均随临床及内镜下病变程度加重,表达逐渐增加,在一定程度上可以反映疾病的活动度。2 UC患者肠黏膜中致炎性细胞因子IL-6表达增加,且随临床及内镜下病变程度加重逐渐增高。3 UC患者肠黏膜中STAT3、p-STAT3的表达均与黏膜组织中IL-6的表达呈正相关,推测STAT3蛋白可能是通过IL-6/JAK/STAT3途径参与UC的发病过程。
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