论文摘要
目的:观察高糖培养下肾小球系膜细胞对ILK的表达以及Benazepril对ILK的表达的干预作用。目前糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)已经成为在美国和欧洲引起终末期肾病(ESRD)最常见的原因,是糖尿病最严重的并发症之一,但是迄今为止DN的发病和早期预防措施并不明确。DN主要的病理改变是:肾小球基底膜增厚、肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cell, GMC)增殖与系膜基质的积聚,最终导致肾小球硬化。GMC是肾小球中最活跃的细胞,对于维持肾脏正常组织结构和生理功能发挥着重要作用,因此积极探讨GMC在生理、病理下的变化机制对于临床DN的防治和早期发现具有重大而深远的的意义。整合素连接激酶(Intergrin-linked Kinase, ILK)是一种存在于细胞胞浆中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,通过多种信号传导通路,包括整合素、生长因子及Wnt信号传导通路,来参与调节细胞的黏附、维持细胞存活、抑制细胞凋亡、控制细胞形态和基因的表达。近年来研究发现正常的肾脏组织中ILK在GMC表达较弱或几乎不表达,但ILK表达的增高常伴随GMC细胞增殖及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)分泌。α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA )是血管平滑肌特有的细胞骨架蛋白,即血管平滑肌的标志,正常成熟的GMC是不表达的。但在病理情况下GMC发生表型转化可表达α-SMA ,其表达情况和GMC增殖改变,细胞外基质的积聚,肾功能持续下降密切联系。而DN早期病理改变主要就是GMC增殖肥大和ECM积聚,因此探讨ILK、α-SMA与GMC增殖及ECM分泌的关系,可以更加深入阐明DN的发病机制。Benazepril(贝那普利)是新一代血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI),它通过抑制血管紧张素转换酶,使循环和组织中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)减少,并同时减少AngⅡ的刺激,阻止其与受体AT1结合。有实验证明高糖刺激下的GMC可自分泌AngⅡ,后者和GMC膜上AT1结合,进而导致了GMC内PKC等通路的活化,引起一些其他细胞生长因子基因和蛋白的异常表达,致使GMC增殖和分化。本实验利用贝那普利进行干预,观察ILK、α-SMA在高糖培养GMC的表达及药物的保护作用,为临床DN防治提供实验性理论依据。方法:肾小球系膜细胞,常规培养消化传代,将其随机分为四组:即正常糖对照组(D-葡萄糖5.5mmol/L,NG组)、甘露醇组(甘露醇20mmol/L,MG组)、高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L,HG组)、高糖+Benazepril干预组(D-葡萄糖30mmol/L+贝那普利10μmol/L,HG+Benazepril)分别培养。四组于实验开始后3、6、12、24、48、72h收集细胞,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测GMC中ILK、α-SMA mRNA的表达,用western blot法检测各实验组GMC中ILK、α-SMA蛋白的表达。结果:1.细胞培养结果:倒置相差显微镜下可见MC呈梭形、不规则星形或三角形的、树枝形,当细胞密集时可重叠生长,胞浆多突起,有大量微丝样结构,核居中央,多呈圆形或椭圆形; 2.高糖环境中GMC ILK mRNA和蛋白水平3h时较正常糖组明显升高(P<0.05),且随时间延长有增高趋势(P<0.05),表达量在48h达到最高(P<0.05),但在72h开始下降(P<0.05)。药物干预后上述指标较高糖组表达水平下降,但未能恢复至对正常照组水平(P<0.01);同时间点甘露醇组ILK mRNA和蛋白水平与正常糖组无明显差别(P>0.05)。3.高糖环境中GMCα-SMA mRNA和蛋白水平较正常糖组升高(P<0.01),随时间延长逐渐增高(P<0.05),表达量在72h达到最高(P<0.01),药物干预后上述指标较高糖组表达水平下降(P<0.01),但未能恢复至对照组水平(P<0.05);同时间点甘露醇组α-SMA mRNA和蛋白水平与较正常糖组升高(P<0.05),不能排除高糖组渗透压依赖性引起的α-SMA升高。结论:上述结果提示1.高糖能以时间依赖的方式诱导ILK在GMC高表达。2.高糖能以时间依赖的方式使α-SMA在GMC表达升高,介导GMC发生表型转化;3.贝那普利可抑制上述作用。4.甘露醇作用下α-SMA异常表达,提示高糖环境下GMC发生明显的表型转化可能同时存在渗透压依赖性。
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