ELISA检测啤酒中泡沫活性蛋白和混浊敏感蛋白及其方法研究

论文摘要

啤酒中的泡沫活性蛋白是啤酒泡沫产生的关键因素之一,混浊敏感蛋白是引起啤酒稳定性下降的主要因素之一。目前,仍然没有一种高效特异的方法检测泡沫活性蛋白和混浊敏感蛋白。为探索一种能快速而有效检测啤酒中泡沫活性蛋白Z4和混浊敏感蛋白的方法,本研究分别利用（NH4）2SO4分级沉淀泡沫活性蛋白Z4和硅胶吸附混浊敏感蛋白,用葡聚糖凝胶层析柱对粗提的两种蛋白进行纯化,并分析了两种蛋白的氨基酸含量,以及用聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱进行鉴定。利用得到的高纯度泡沫活性蛋白Z4和混浊敏感蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术建立了两株能分泌抗泡沫活性蛋白Z4和抗混浊敏感蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为:D1H8和G2H9;C6B7和E10D7,并制备出了对应的单克隆抗体。间接酶联免疫法测定抗体（腹水）的效价均在106以上,两种蛋白的交叉反应率均较低,表现出很高的特异性。在此基础上,通过对包被条件、洗涤次数、封闭时间、工作浓度等因素的筛选比较,优化了测定泡沫活性蛋白Z4和混浊敏感蛋白ELISA方法的条件。优化结果显示:S-BA-ELISA法测定泡沫活性蛋白Z4最佳包被缓冲液为0.05M pH8.0 PBS,最佳抗体包被条件为4℃过夜,浓度为10mg/L;生物素标记单抗最适浓度为5mg/L;最佳底物显色时间为15min。双抗体夹心法测定混浊敏感蛋白抗体最佳包被浓度为15mg/L;BSA封闭时间为120min;二抗（兔抗）最适浓度为10mg/L,最适孵育时间为60min;最佳显色时间为15min。泡沫活性蛋白Z4的浓度在43～125μg/L时,线性相关性较高,线性回归方程为Y=3.6876·Lg[X]-5.2818（R2=0.963,n=8）,5个样本重复测定5次结果变异系数均小于20%,结果较为可靠。用所建立的双抗体夹心法测定混浊敏感蛋白与泡沫活性蛋白Z4没有交叉反应且有较好的重复性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 啤酒泡沫的概述
• 1.1.1 啤酒中的泡沫活性蛋白
• 1.1.2 泡沫活性蛋白Z
• 1.1.3 泡沫活性蛋白Z4
• 1.2 啤酒混浊的概述
• 1.2.1 啤酒的非生物混浊
• 1.2.2 混浊敏感蛋白
• 1.3 单克隆抗体的概述
• 1.3.1 杂交瘤技术的基本原理
• 1.3.2 酶联免疫检测技术（ELISA）
• 1.4 立题背景
• 1.5 本课题的创新之处
• 1.6 课题研究的内容及目标
• 第二章 泡沫活性蛋白和混浊敏感蛋白的提取纯化及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 啤酒中总氮的测定
• 2.2.2 氨基酸组分分析结果
• 2.2.3 泡持性的测定结果
• 2.2.4 泡沫活性蛋白Z4 和混浊敏感蛋白的定量结果
• 2.2.5 泡沫活性蛋白的提取纯化及鉴定
• 2.2.6 混浊敏感蛋白的提取纯化及鉴定
• 2.3 本章小结
• 第三章 泡沫活性蛋白和混浊敏感蛋白单克隆抗体的制备和鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定
• 3.2.2 细胞融合
• 3.2.3 杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.4 腹水抗体蛋白含量的测定
• 3.2.5 小鼠腹水效价的测定
• 3.2.6 抗体亚类的测定结果
• 3.2.7 Western Blot 鉴定
• 3.3 本章小结
• 第四章 ELISA 法测定泡沫活性蛋白和混浊敏感蛋白方法的建立
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 生物素标记抗泡沫活性蛋白Z4 单克隆抗体效价的测定
• 4.2.2 S-BA-ELISA 法测定泡沫活性蛋白Z4 条件优化
• 4.2.3 S-BA-ELISA 法测定泡沫活性蛋白Z4 工作曲线的绘制
• 4.2.4 双抗体夹心法测定混浊敏感蛋白检测模式的建立
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论和展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 术语和缩略语表
• 在读期间发表论文
• 致谢