番茄MBF1转录辅激活因子基因的克隆表达分析及遗传转化

论文摘要

逆境胁迫因子主要有干旱、盐渍、低温、水涝等,是限制植物生长和区域分布以及影响农作物产量和质量的重要因素。植物对这些逆境胁迫的适应主要被转录因子和调节基因（诸如控制多重抵御的酶、蛋白等）所介导。现有研究证明,与转录因子活力有关联的是转录辅激活子,它能增强转录因子和顺式作用元件的结合。MBF1是一个转录辅激活子,通过一个激活物和一个TATA盒结合蛋白的桥连作用来调节转录激活。MBF1基因最早是在蚕、果蝇等动物体中被发现,后来在植物中也发现了MBF1基因。据报道,在拟南芥中的MBF1基因的超表达能增强其抵抗逆境胁迫的能力,而在番茄中关于此基因还没有相关的报道,本论文拟通过在番茄中超表达MBF1基因研究其对逆境胁迫的抗性能力,从而明确MBF1基因的分子作用机制,主要研究内容及结果如下:1.番茄MBF1基因的克隆以AC++番茄果实的总RNA为模板,体外反转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过PCR扩增得到得632 bp大小的片段,将其命名为LeMBF1,并登录NCBI GenBank,登录号为EF051474。将其与拟南芥中的MBF1基因进行同源性比较,在氨基酸水平上的序列相似性为82%,是一个新基因。2. Northern杂交技术分析番茄LeMBF1基因的表达特性克隆番茄MBF1（LeMBF1）基因特异片段,以此作为探针,通过Northern杂交技术分析LeMBF1基因的表达特性,结果显示LeMBF1基因的表达能被高温、干旱诱导,被复水所影响,同时LeMBF1基因的表达水平也在Nr （Never-ripening, Nr）番茄and rin（ripening inhibitor, rin）番茄中被检测。外源乙烯处理绿熟期果实,LeMBF1基因的表达变化不明显,说明在这一时期外源乙烯并不诱导LeMBF1基因的表达。3.双元超表达载体pBIN19-MBF1的构建验证的LeMBF1基因与经Pst I酶切的pDH51载体通过T4 DNA连接酶连接,连接产物转经PCR以及酶切鉴定确为重组中间载体质粒,且外源片段方向正确,命名为pDH51-MBF1。中间载体pDH51-MBF1经EcoR I酶切获得了包含35S启动子、MBF1基因、35S终止子的片段,此片段与经EcoR I酶切的pBIN19载体连接,连接产物经PCR及酶切鉴定确为重组植物双元表达载体质粒,命名为pBIN19-MBF1。4.再生番茄植株的获得以AC++番茄子叶为外植体,通过农杆菌LBA4404介导,将CaMV 35S启动子调控下的LeMBF1转入番茄,经过50 mg/L Kan及500 mg/L的Sm筛选,获得一部分生根的再生植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 植物逆境反应的生理基础
• 1.2.1 植物的抗逆性
• 1.2.2 植物在一般逆境下的生理变化
• 1.3 植物逆境应答的分子机制
• 1.3.1 植物对逆境的应答
• 1.3.2 植物逆境的信号转导与调控因子
• 1.3.3 顺式调控原件
• 1.3.4 转录因子（反式作用因子）
• 1.4 核受体转录辅激活因子
• 1.4.1 核受体
• 1.4.2 转录辅激活因子的结构
• 1.4.3 转录辅激活因子的作用机制
• 1.4.4 核受体辅调节因子促进基因表达
• 1.4.5 MBF1（Multiprotein Bridging Factor 1）基因的研究进展
• 1.5 研究的目的及意义
• 1.6 研究的主要内容
• 1.7 技术路线
• 1.7.1 番茄LeMBF1 基因的克隆及表达模式的研究
• 1.7.2 LeMBF1 超表达载体的构建
• 1.7.3 番茄的转化
• 1.8 本论文的创新点
• 2 番茄MBF1 基因的克隆
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料、质粒、菌株、试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 常用试剂配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 番茄总RNA 的提取
• 2.2.2 核酸质量及浓度测定
• 2.2.3 克隆番茄LeMBF1 基因全长
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 普通番茄总RNA 的提取
• 2.3.2 MBF1 基因的克隆
• 2.4 讨论
• 3 番茄 LeMBF1 基因的表达模式研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 3.1.4 试剂的配置
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 番茄果实的采集
• 3.2.2 环境胁迫和乙烯处理番茄植株
• 3.2.3 总RNA 的制备
• 3.2.4 Northern 杂交
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同温度对番茄LeMBF1 基因表达的影响
• 3.3.2 干旱、复水对番茄LeMBF1 基因表达的影响
• 3.3.3 伤害对WT、Nr 和rin 番茄叶中MBF1 基因表达的影响
• 3.3.4 乙烯对番茄MBF1 基因表达的影响
• 3.4 讨论
• 4 番茄 LeMBF1 超表达载体的构建、转化与鉴定
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 植物材料、质粒、菌株
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 4.1.4 实验所用试剂的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 质粒 DNA 的制备
• 4.2.2 MBF1 基因重组到过渡载体pDH51
• 4.2.3 植物表达载体的构建
• 4.2.4 番茄的遗传转化
• 4.2.5 农杆菌介导的番茄转化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 LeMBF1 基因构建到过渡载体pDH51 上的PCR 鉴定及酶切鉴定
• 4.3.2 植物表达载体的构建与鉴定
• 4.3.3 番茄的遗传转化
• 4.4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录