论文摘要
农药是当今人们保障、促进植物和农作物生长必不可少的重要农业生产资料,百草枯（Paraquat, PQ）是一种非选择性有机杂环类接触性除草剂,因其除草效能高、低污染、接触土壤后迅速失活、低残留等优点而在全球广泛应用。但是PQ对人畜有较强的毒性,随着PQ在全球的广泛使用,PQ中毒的事件呈逐年上升趋势,尤其是在农村,多数系农民口服自杀所致。由于没有特效的解毒药,PQ中毒的病死率高达80%以上。PQ可以经由呼吸道、皮肤接触及消化道吸收等多种途径进入体内,并随血液分布至全身各组织器官,造成多种脏器功能的损害,尤其是急性肺损伤（Acute lung injury, ALI）和进行性肺纤维化,是PQ中毒死亡的主要原因,其中毒机制目前尚未完全清楚。PQ对肺组织具有较强的亲和力,肺脏是PQ损伤的主要靶器官,Ⅰ型及Ⅱ型肺泡上皮细胞是PQ选择性毒作用的靶细胞。PQ能在肺组织中异常大量的聚集是因为肺内存在聚胺类物质摄取系统,PQ和二胺、多胺等具有结构上的相似性,PQ可与胺类物质竞争通过肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径而选择性地在肺内聚集,低浓度PQ可通过此能量依赖性的多胺摄取系统在肺组织内聚集,但在高浓度PQ作用的情况下该系统失活,主要通过弥散途径进入细胞。在PQ中毒早期,主要表现为急性肺泡炎症、肺水肿、充血等ALI症状,进而诱发急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distresssyndrome, ARDS）,最终死于呼吸衰竭,即便在中毒早期能幸存下来,数周后仍然会出现不可逆转的肺纤维化,导致患者死亡。因此,弄清PQ引发ALI的机制,寻找PQ阻断剂或者寻找到能够促使PQ尽早尽快代谢的无毒害物质,是有效治疗和预防PQ中毒的关键。近年来,一些研究结果提示PQ中毒所造成的ALI主要与活性氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）过度产生有关。PQ进入体内后,经过一系列的氧化还原反应能够迅速产生大量的ROS,过量的ROS攻击肺组织,从而引起肺脏的氧化损伤。金属硫蛋白（Metallothionein, MT）是一类存在于生物体内的低分子量、富含巯基的、可被金属诱导产生的金属结合蛋白。MT具有多种生物学效应,其抗氧化、清除自由基的功能尤其引人关注。因此,本课题选用MT基因敲除动物,通过观察MT-Ⅰ/Ⅱ基因型敲除（MT-/-）小鼠及与之相对应的野生型（MT+/+）小鼠对PQ中毒敏感程度的差异,从分子水平深入研究机体内重要内源性保护蛋白MT是否对PQ致ALI存在保护作用,探讨MT在PQ引发ALI中的作用及可能机制,为寻找到能够有效拮抗PQ毒害作用的内源性物质提供理论和实验依据。本研究首先应用镉-血红素饱和法检测C57BL/OLA129 MT-Ⅰ/Ⅱ型基因敲除（MT-/-）小鼠及其同源野生型（MT+/+）小鼠肺组织MT含量,结果显示MT+/+小鼠肺组织MT含量约为MT-/-小鼠的3倍,由此验证了实验模型的可靠性。PQ染毒后24小时,MT+/+小鼠肺组织MT含量显著高于MT-/-小鼠。MT+/‘小鼠及MT-/-小鼠给予PQ处理后24小时,均出现食欲减退、摄食量和饮水量明显减少、体重减轻、行动迟缓、呼吸急促等表现。经PQ处理的MT+/+小鼠与未处理的MT+/+小鼠相比较,肺脏湿重/体重比无显著性差异（P>0.05）,而MT-/-小鼠给予PQ处理后其肺脏湿重／体重比明显增加,显著高于未处理的MT+/+小鼠（P<0.05）。PQ处理前,MT+/+小鼠和MT-/-小鼠血液中WBC数目接近。PQ染毒后24小时,两种小鼠血液中WBC数目显著升高（P<0.05）,但两种小鼠之间WBC数目无显著性差异（P>0.05）。PQ中毒可改变肺脏组织结构,本研究表明PQ染毒后24小时,两种小鼠均出现肺泡壁增厚,毛细血管扩张充血,肺组织内有炎症细胞浸润,严重的肺出血,肺泡腔消失,其内充满大量的炎症细胞和渗出液；MT+/+小鼠和MT-/小鼠两种小鼠相比较,可见MT-/-小鼠肺脏病变程度较MT+/+小鼠严重。丙二醛（MDA）是组织脂质过氧化产物的终产物之一,其含量可反映组织细胞的脂质过氧化程度,采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定MDA的含量。结果显示,染毒前,MT+/+小鼠和MT-/-小鼠肺脏组织中MDA含量接近；PQ染毒后,两种小鼠肺组织中MDA含量均显著增加,而且MT-/-小鼠肺脏脂质过氧化程度显著高于MT+/+小鼠。MT对PQ致小鼠肺脏组织抗氧化防御系统损伤起一定的保护作用,与MT+/+小鼠相比,MT-/-小鼠在PQ染毒后,肺组织中非酶类抗氧化物GSH含量及抗氧化物酶SOD、CAT、GSH-px和GR活性均显著降低。以上实验结果表明,PQ致ALI的机制与自由基产生和氧化损伤有关,MT对PQ所致的肺组织毒性具有明显的保护作用。肺脏组织细胞凋亡是PQ引起ALI的另一机制,近年来有实验研究表明,自由基介导的肺组织细胞凋亡可能在PQ致肺组织病变中发挥关键作用。线粒体损伤及其功能紊乱是PQ致肺组织细胞凋亡的早期征兆。本研究采用TUNEL免疫组化法检测肺组织细胞凋亡,并应用蛋白印记的方法测定Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表达情况。结果表明,PQ可诱导小鼠肺组织发生严重的细胞凋亡,与MT+/+小鼠相比,MT-/-小鼠在PQ染毒后,肺组织的细胞凋亡指数显著升高,Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达及Bax/Bcl-2值显著升高。由此表明,MT能抑制PQ引起的肺组织细胞凋亡。MT可以抑制Bax蛋白的表达、降低被称为细胞“死亡开关”的Bax/Bcl-2比值,通过抑制线粒体依赖的Caspase途径的启动从而抑制细胞凋亡。综合本研究结果,PQ能够导致小鼠肺脏急性损伤,PQ导致的小鼠急性肺损伤与自由基产生和氧化损伤有关。PQ亦可诱导小鼠肺组织发生严重的细胞凋亡。MT能够减轻PQ所致的小鼠肺急性损伤程度以及肺组织细胞凋亡,其具体的拮抗机制与MT清除自由基及抗氧化功能有关。
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