植物ADH基因家族的生物信息学分析及棉花Zn结合脱氢酶的克隆与原核表达

论文摘要

在本研究中,我们用生物信息学的方法分析了玉米等物种ADH的保守功能域、蛋白二级结构和进化关系。分析证实,植物ADH通常含有3个保守功能域,它们是具有GroES结构的ADHN结构域,Rossmann折叠NAD（P）（+）结合蛋白和锌结合位点,这3个保守结构在各个物种中具有相当的保守性。二级结构的分析表明,在我们研究的物种中,每个物种的两个ADH同工酶折叠情况大体相同,物种间蛋白二级结构也趋向一致。通过构建系统进化树,分析了供试物种中ADH以及ADH两个同工酶间的进化关系。初步显示,在进化上,单、双子叶植物源自不同的ADH祖先。双子叶植物ADH在物种间具有差异；而在单子叶植物不同物种其ADH同工酶出现分化。我们对一个百脉根的匿名序列（序列编号为CAG3057 9.1）进行了保守结构域预测、二级结构以及进化关系分析,初步推定该匿名序列为百脉根乙醇脱氢酶基因的未知同源基因LcADH（t）。保守结构域预测LcADH（t）含有ADHN、NADBRossmann和锌结合位点这3个典型的ADH结构域。LcADH（t）的二级结构显示出与其他ADH极高的相似性,尤其体现在3个保守结构区。同时,在核苷酸和氨基酸序列上,与LcADH1又存在着一定的差别,这意味着LcADH（t）与LcADH1并非同一基因,且这种差别也非同一基因的种间差别。从进化关系分析上可知LcADH（t）与LcADH1之间在同一类的两个不同分支,据此,我们推断,LcADH（t）可能发挥着LcADH2的功能,值得期待进一步的功能验证。我们通过对陆地棉的一个409bp的cDNA片段进行解析,in silico拼接出一条完整的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）。我们推定这条ORF在陆地棉中真实存在,并在阅读框的两端设计了扩增引物,PCR扩增正向引物为：5—CACCACTAGATCACAAGAATAATAATGG—3,反向引物为：5—AAAAGGAGAAGCAATTTACATTATCTC—3.以陆地棉总RNA进行反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增,获得全长基因序列。ORF分析表明,序列中包含一个1305bp的ORF,编码434个氨基酸。通过BLAST和多重序列比对,我们克隆的序列可能是一个锌结合脱氢酶家族蛋白的同源蛋白,将其命名为棉花锌结合脱氢酶蛋白（cotton zinc-binding dehydrogenase family protein）,将该基因命名为GhZBDH。保守结构域分析表明,从氨基酸链的63位至433位,是进行能量制造与转化的第三类锌结合乙醇脱氢酶AdhC结构域,87至221位是ADHN结构域,269至394位是NAD （P）结合蛋白结构域。结构域预测的结果进一步暗示,这个蛋白质在一级结构上具有与其他物种ADH类似的构成状况,可能发挥着ADH功能。我们成功的将棉花锌结合脱氢酶基因构建到PQE-30载体之中,重组载体命名为pQE30-GhV3。然后应用热激转化法将pQE30-GhV3重组载体转化入表达菌株M15中,进行诱导表达。表达研究证明,这个蛋白表达的最适合温度为37℃,最适IPTG浓度为0.1mmol/L,最适诱导时间为3小时。我们在37℃、0.1mmol/L浓度的IPTG条件下,诱导3小时,使用Ni-NTA凝胶亲和层析柱进行层析,电泳分离纯化产物。结果显示,GhZBDH表达蛋白量很大,且其大小与预测的完全一致,初步表明,我们获得了大量的且高纯度的变性蛋白,为下一步的蛋白复性以开展定性实验准备了条件。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 引言
• 第二部分 文献综述
• 1. 植物锌结合脱氢酶
• 1.1 乙醇脱氢酶的克隆及其功能研究
• 1.1.1 植物乙醇脱氢酶的克隆
• 1.1.2 乙醇脱氢酶的功能研究
• 1.2 山梨醇脱氢酶的克隆及其功能研究
• 1.2.1 植物山梨醇脱氢酶基因的克隆
• 1.2.2 山梨醇脱氢酶的功能研究
• 1.3 谷氨酸脱氧酶的克隆及其功能研究
• 1.3.1 谷氨酸脱氧酶基因的克隆
• 1.3.2 谷氨酸脱氧酶的功能研究
• 1.4 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的克隆及其功能研究
• 1.4.1 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的克隆
• 1.4.2 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的功能研究
• 2. 植物中的其他重要含锌酶
• 2.1 碳酸酐酶
• 2.1.1 碳酸酐酶在干旱中的表现
• 2.1.2 碳酸酐酶在光照、高盐、高温、缺氮、缺钾环境中的活性变化
• 2.2 超氧化物歧化酶
• 2.2.1 SOD基因的克隆
• 2.2.2 棉花中SOD研究进展
• 3. 生物信息学概述
• 3.1 序列片段的拼接
• 3.2 基因区域的预测
• 3.3 基因功能预测
• 3.4 分子进化的研究
• 第三部分 乙醇脱氢酶（ADH）家族生物信息学分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 数据来源与获取
• 2.2 数据处理与计算机软件
• 2.2.1 保守结构域预测
• 2.2.2 二级结构预测
• 2.2.3 多重序列比对和系统树构建
• 3.结果与分析
• 3.1 ADH的保守结构域分析
• 3.2 玉米等物种中MDH的二级结构分析
• 3.3 玉米等物种中ADH的多重序列比对和进化关系分析
• 4.讨论
• 5.小结
• 第四部分 一个新的百脉根乙醇脱氢酶基因（LcADH（t））的in silico注释
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 数据序列来源与获取
• 2.2 数据处理与计算机软件
• 2.2.1 LcADH（t）保守结构域预测
• 2.2.2 LcADH（t）二级结构预测
• 2.2.3 LcADH（t）与其他物种的多重序列比对和进化树构建
• 3.结果与分析
• 3.1 LcADH（t）的保守结构域分析
• 3.2 LcADH（t）的二级结构分析
• 3.3 LcADH（t）与其他物种的多重序列比对和进化树分析
• 4.讨论
• 5.小结
• 第五部分:陆地棉锌结合脱氢酶基因克隆及生物信息学分析
• 1.前言
• 2.材料和方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试植物材料
• 2.1.2 棉花EST序列的获得
• 2.1.3 主要分子生物学试剂
• 2.1.4 制备大肠杆菌感受态细胞所需试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 基于EST的in silico分析及引物设计
• 2.2.2 棉花总RNA的提取
• 2.2.3 RNA反转录成cDNA
• 2.2.4 PCR以及产物的回收
• 2.2.5 连接与转化
• 2.2.6 重组质粒DNA的提取与酶切鉴定
• 2.2.7 锌结合脱氢酶基因的序列对比和分析
• 2.2.8 推导氨基酸序列的保守结构域预测以及二级结构预测
• 3.结果与分析
• 3.1 棉花锌结合脱氢酶基因（GhZBDH）的克隆
• 3.2 棉花锌结合脱氢酶蛋白基因（GhZBDH）的序列对比和分析
• 3.3 棉花ZBDH的功能预测
• 3.3.1 棉花锌结合脱氢酶（GhZBDH）的保守结构域预测以及二级结构预测
• 4.讨论
• 5.小结
• 第六部分:棉花锌结合脱氢酶（GhZBDH）的原核表达与蛋白纯化
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原核表达载体pQE 30-GhV3构建及转化
• 2.2.2 His-V3融合蛋白的小量诱导表达
• 2.2.3 棉花锌结合脱氢酶蛋白在大肠杆菌中的大量表达与纯化
• 3.结果与分析
• 3.1 原核表达载体pQE 30-GhV3构建、转化及鉴定
• 3.2 pQE 30-GhV3融合蛋白的小量诱导表达
• 3.3 棉花锌结合脱氢酶蛋白在M15中的大量表达与纯化
• 4.讨论
• 5.小结
• 第七部分:讨论
• 1.ADH的进化历史
• 2.基于全基因组测序数据注释新基因——百脉根的LcADH（t）
• 3.基于全基因组测序数据PCR克隆新基因——棉花的GhZBDH
• 4.GhADH在棉花抗黄萎病过程中执行什么功能?
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3:图版
• 致谢