1，25（OH）2D3对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化调节作用的研究

论文摘要

目的:肾脏纤维化包括肾小球硬化与肾间质纤维化,是各种原发、继发肾小球疾病和非肾小球疾病所致肾脏疾病终末期的共同表现。大量研究表明肾间质纤维化程度对长期肾功能来说更为重要,因此肾间质纤维化越来越多地受到人们的重视。如何防治肾间质纤维化成为目前肾脏病领域的研究热点之一。作为抑制肾间质纤维化调节因子的肝细胞生长因子（HGF）和骨形态发生蛋白-7（BMP-7）,目前在肾脏领域颇受重视。HGF在肾脏主要表达于肾间质细胞、肾小球内皮细胞和巨噬细胞,以内分泌、自分泌和旁分泌的形式特异性作用于靶细胞,发挥其对肾脏的保护作用。而BMP-7属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族,它不仅在肾脏的发生作用中发挥至关重要的作用,并且可以治疗多种肾小管和肾间质疾病。伴随抑制纤维化因子而来的致纤维化因子TGF-β1的高表达参与肾间质纤维化的各个步骤,其诱导的信号传导通路激活是上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition EMT）机制中最为重要的环节,抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）在肾间质纤维化发生发展中的作用,可能是一种有效的防治纤维化的手段。1,25（OH）2D3作为维生素D（VitD）经肝、肾代谢后的主要活性形式,具有很重要的生物学活性。在维持机体正常钙磷代谢及骨的正常发育中起着关键作用。然而,近年来随着对1,25（OH）2D3的不断研究,其肾脏保护作用已不仅仅局限于对血钙、磷和PTH水平的调节,但其确切机制尚未明了,对于这种新机制的研究有助于重新评价1,25（OH）2D3在治疗肾脏病中的意义。单侧输尿管接扎（UUO）是一成熟的肾间质纤维化模型,肾小球病变不明显,本试验以此动物模型为平台,选用1,25（OH）2D3干预,通过观察肾脏病理改变、免疫组织化学方法检测HGF、BMP-7、TGF-β1的表达变化,从细胞水平探讨1,25（OH）2D3抗肾间质纤维化,保护肾功能的机制。方法:选择清洁级健康雄性Wistar大鼠54只,体重（200±10）克,随机分为三组:假手术组（A组）,输尿管结扎组（UUO组即B组）,1,25（OH）2D3治疗组（C组）,每组各18只。每组又因于术后第3、7、14天分批处死而分为N3、N7、N14组,每组各6只。将各组大鼠以水合氯醛（0.1ml/kg）腹腔注射麻醉后,行左侧耻骨上切口,沿左肾下极寻找到左侧输尿管,在中上1/3处用4号线上下结扎两处,然后从中间剪断输尿管,以防逆行性感染,假手术组除不结扎和剪断输尿管外,其他手术过程均同前。术后各组大鼠均正常饮食。1,25（OH）2D3治疗组大鼠以0.1mL1,25（OH）2D3混悬液9ng/100g/d灌胃,1次/日;假手术组和UUO组大鼠用等量花生油灌胃,1次/日三组均于术前一天开始灌胃至术后第3天、第7天和第14天,分三批留取标本。输尿管结扎术后分别于第3、7、14天处死,大鼠处死前留取血标本,检测血清钙（Ca）、磷（P）浓度,迅速取出左肾,按冠状位纵形切开,取肾组织的1/2置于10%福尔马林固定液固定,酒精逐级脱水,二甲苯透明石蜡包埋,制成5um切片。光镜HE、Masson染色观察肾脏病理变化。采用免疫组织化学染色测定肾间质BMP-7、HGF、TGF-β1的表达,结果应用图像分析系统进行半定量分析。实验结果均以均数±标准差（x±s）表示,各组间比较采用单因素方差分析,应用SPSS 11.0统计分析软件对实验数据进行统计学处理,P<0.05为有统计学意义。结果:与A组相比,B组及C组的血Ca、P轻度升高但无统计学差异。光镜下观察,HE及Masson染色A组未见异常,B组及C组各时相点大鼠肾脏肾小球无明显变化。HE染色B组术后3天肾小管扩张不明显,间质中少量单核细胞与淋巴细胞浸润,肾间质宽度增加;B组7天可见肾小管扩张明显,上皮细胞变性、水肿、甚至坏死,肾间质大量炎症细胞浸润,间质宽度明显增加,偶见萎缩肾小管;B组14天上述病变加重,可见弥漫的肾小管基底膜增厚皱缩,小管基底膜不同程度断裂,皮质及外髓萎缩的肾小管较多,间质中大量淋巴单核细胞浸润,纤维化较明显。Masson染色可见B组术后3天肾小管扩张,肾间质宽度增加,胶原纤维增加,染色加深;此后,病变逐渐加重。C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻,肾间质相对面积明显减少（P<0.01）。三组间比较均有统计学差异（P<0.01）。免疫组织化学结果显示:BMP-7在A组高度表达,肾脏髓质区表达明显高于皮质区的表达,主要分布于肾小管及肾间质,在升支小管上皮、远曲小管、集合管均有表达,在直部及皮髓质交界处染色最强,近曲小管仅有少量表达,而在肾小球内基本无表达。在B组各时相点BMP-7蛋白的表达随时间呈进行性下降,且随着梗阻时间延长减弱程度更加明显,第14天表达最弱,几乎无明显阳性表达。B组组间及与A组同时相点相比均有统计学差异（P<0.05）。C组术后第3天、第7天、第14天BMP-7的表达均显著高于同时期B组的表达（P<0.05）。HGF在肾小管间质的表达:在A组各时期均几乎无表达。在B组、C组主要表达于肾小管上皮细胞,肾间质有少量表达,3天时HGF表达较正常轻度增高,7天时表达至高峰,14天时表达减少,有统计学意义（P<0.05）。C组与B组同时相点相比HGF的表达均增高,组间、组内均有统计学差异（P<0.05）。TGF-β1在肾小管间质的表达:在A组各时期仅肾小球、肾小管间质微量表达,主要分布于肾小管上皮细胞胞浆内,B组各时相点TGF-β1蛋白的表达随时间呈进行性升高,且随着梗阻时间延长升高程度更加明显,至第14天表达最强。组间、组内均有统计学差异（P<0.05）。进一步对各组BMP-7、HGF蛋白的表达与TGF-β1的表达进行相关性分析,结果显示,BMP-7、HGF与TGF-β1的表达均显著负相关（P<0.05）。结论:本实验进一步证实了BMP-7、HGF及TGF-β1的表达部位及其表达与肾间质纤维化的关系。且1,25（OH）2D3能够明显减轻肾间质纤维化,上调BMP-7、HGF蛋白的表达,进而使TGF-β1的表达下降,从而发挥其在单侧输尿管结扎模型中对肾脏的保护作用,延缓和抑制了肾间质纤维化的发展。研究也发现1,25（OH）2D3抑制和延缓肾间质纤维化的进展,不依赖于其对钙磷的调节作用。

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• 2D₃对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化调节作用的研究'>研究论文 1,25（OH）₂D₃对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化调节作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 抗纤维化因子在肾间质纤维化中的研究进展
• 致谢
• 个人简历