精神分裂症相关蛋白dysbindin-1在神经发育中的作用

论文摘要

精神分裂症是一种严重的精神疾病,它具有很强的遗传背景。流行病学调查揭示了约有0.5%-1%的人口会罹患此病。到目前为止,许多基因都被发现与精神分裂症发病相关。本论文关注的DTNBP1基因（编码蛋白dysbindin-1）序列中的一些单核苷多态性位点已经被证实是精神分裂症发病的风险因素。更为重要的是,在精神分裂患者大脑皮层区dysbindin-1的蛋白水平被发现有显著下调,而在精神分裂患者海马区中,dysbindin-1 mRNA水平也被发现是显著减少的。大脑高级认知功能的研究显示DTNBP1基因上的单核苷多态性与前脑功能有关。因此dysbindin-1的功能被认为与精神分裂症的发病密切相关。过去对dysbindin-1的功能研究显示其在突触前膜和后膜上都可以调节神经突触功能的活性。这种调控能力被认为是通过与一些位于突触的蛋白结合而调节神经突触递质释放和信号转导功能。因此Dysbindin-1在脑中的减少可能影响了递质系统从而增加了罹患精神分裂症的风险。近来也有一些研究认为dysbindin-1参与了神经发育过程,然而机制还不清楚。由于神经发育异常也被认为是精神分裂发病的一个相关因素,因此对dysbindin-1参与神经发育的机制研究将有助与我们了解精神分裂症的发病。在本文中,我们首先使用酵母双杂交系统在人类胎脑文库中为dysbindin-1寻找到了一个新的结合蛋白：necdin。并且证实了dysbindin-1通过调节necdin的胞内分布影响核内重要转录因子p53的转录活性,最终通过p53影响了神经发育过程。主要研究结果如下：1、我们运用酵母双杂交系统,在人胎脑文库中筛选到了dysbindin-1新的结合蛋白：necdin。通过体外pulldown和免疫共沉淀的实验方法进一步证实了这个结合,并且发现dysbindin-1第97-118氨基酸序列为介导其与necdin结合的一个重要domain。我们同时运用细胞免疫化学和报告基因测试证明了dysbindin-1通过与necdin结合并且促进necdin由胞核转运到细胞质之中。由于necdin是一个核内转录抑制因子,dysbindin-1通过改变necdin的定位也进一步促进了核内转录因子p53的转录活性。2、由于p53的转录活性对于神经早期发育非常重要,因此我们进一步将dysbindin-1促p53转录活性的作用与神经发育联系起来。我们在培养细胞系中敲减dysbindin-1的表达引起了细胞分化中突起生长障碍。进一步通过RT-PCR技术检测,显示了dysbindin-1表达减少之后,p53转录调控的神经发育相关蛋白Coronin 1b和Rab13的表达也因此减少。在敲减了内源性dysbindin-1而导致神经突起生长障碍的培养细胞系中超表达外源性p53可恢复细胞神经突起生长的能力。这些结果表明了dysbindin-1通过p53途径影响神经突起发育。3、在dysbindin-1缺失的小鼠品系sandy mice中的检测,也表明p53下游转录调节的蛋白p21、Coronin 1b以及Rab13相比与野生型鼠都有显著减少。在体外培养的sandy mice大脑皮层原代神经元神经突起生长长度相比于野生型鼠也有显著变短。进一步证实了在体水平上dysbindin-1通过影响p53转录而影响神经发育的可能。综上所述,本文系统性的论证了dysbindin-1通过对necdin细胞定位的影响而调节了p53转录活性的影响,为dysbindin-1参与神经发育过程提供了一个分子机制上的解释。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论（精神分裂症相关蛋白dysbindin-1研究进展）
• 1.1 引言
• 1.2 精神分裂症概述
• 1.3 精神分裂与遗传因素
• 1.4 精神分裂症发病机制的研究
• 1.4.1 精神分裂症发病与神经递质系统
• 1.4.2 精神分裂症发病与神经发育
• 1.5 精神分裂症发病相关蛋白dysbindin-1的研究进展
• 1.5.1 DTNBP1基因及其编码蛋白dysbindin-1简介
• 1.5.2 DTNBP1与精神分裂症发病的关系
• 1.5.3 Dysbindin-1在脑中的表达以及其亚细胞定位研究
• 1.5.4 Dysbindin-1的功能研究进展
• 1.6 p53对神经元发育的影响
• 第2章 材料与方法
• 2.1 相关质粒构建
• 2.1.1 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）
• 2.1.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.3 从琼脂糖凝胶上回收DNA片段
• 2.1.4 质粒DNA或DNA片段的限制内切性酶酶切
• 2.1.5 DNA片段的连接反应（TaKaRa DNA Ligation Kit）
• 2.1.6 大肠杆菌（JM109和BL21（DE3））化学感受态细胞的制备
• 2.1.7 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.1.8 大肠杆菌质粒DNA小量抽提
• 2.1.9 基于PCR的DNA定点突变（TaKaRa MutanBEST Kit）
• 2.1.10 本论文所需质粒的构建
• 2.2 酵母双杂交筛选以及酵母生长检测
• 2.3 体外结合实验
• 2.3.1 重组蛋白质在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3.2 GST Pull-down
• 2.4 细胞培养
• 2.5 动物实验
• 2.6 原代神经元的分离以及培养
• 2.7 细胞转染（脂质体转染法）
• 2.8 免疫共沉淀（Co-immunocipitation,Co-IP）
• 2.9 蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.10 Western Blot
• 2.11免疫细胞化学
• 2.12 RNA干扰
• 2.13 药物处理
• 2.14 RNA抽提和RT-PCR检测
• 2.15 细胞分化实验以及突起生长检测
• 2.16 报告基因活性的检测（以24孔板为例）
• 2.17 MTT法检测活细胞（以24孔板为例）
• 2.18 数据分析
• 第3章 结果与讨论
• 3.1 引言
• 3.2 Necdin与dysbindin-1的结合鉴定
• 3.3 Dysbindin-1改变necdin的定位并影响p53的转录活性
• 3.4 Dysbindin-1的97-118位氨基酸序列参与调节necdin
• 3.5 Dysbindin-1通过调节p53下游基因产物影响分化细胞突起生长
• 3.6 在体水平上dysbidnin-1对突起生长调节的研究
• 3.7 讨论
• 3.8 总结与展望
• 3.8.1 总结
• 3.8.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文