苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究

论文摘要

铁蛋白是一种铁贮藏结合蛋白，广泛存在于植物、动物、微生物中，由24个亚基组成450KD的巨大复合体，可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子，在生物体内铁的代谢方面起着关键作用。 苹果是世界范围内广泛栽培的果树，但目前关于苹果铁蛋白基因的克隆和表达特性的研究却很少。本试验研究了苹果和梨铁蛋白基因和启动子的克隆，以及铁蛋白基因在转基因和非转基因苹果基因组中的表达特性，对转基因苹果基因组中铁蛋白基因表达的影响因素进行了探讨，并利用番茄作为模式植物对外源铁蛋白基因在转基因苹果基因组内的表达进行了预测。 1．根据已报道植物铁蛋白基因（ferritin）的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘嘎拉’苹果（Malus domestica Borkh．cv‘Gala’）叶片中获得苹果铁蛋白基因（MdFer）的全长序列。该基因已被GenBank数据库收录，登录号为DQ099429。该cDNA共含1043个碱基，编码区831bp，编码277个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有209bp左右的3’端尾随序列区。通过GenBank同源性比对发现，该基因与大豆、豇豆、拟南芥、烟草、小金海棠、小麦、水稻、玉米铁蛋白基因氨基酸序列同源性分别为85％、83％、82％、80％、75％、74％、72％、71％。Southern杂交结果显示，Ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5mM的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗的茎段不同时间后的定量RT-PCR表明，该基因随着诱导时间的延长表达量增加，说明‘嘎拉’苹果的铁蛋白基因在转录水平上受铁诱导表达。同时利用Promoter Walking方法从‘嘎拉’苹果基因组中克隆出MdFer的启动子序列。该启动子序列具有G-box、BlockⅡ、SHS等铁蛋白基因启动子所共有的序列特征，并且在-83—-70bp的位置与ZmFer1启动子的IDRS（Iron-dependent Regulation Sequence）区域同源性较高。 2．根据已报道植物铁蛋白基因的保守区域设计引物，用RT-PCR和RACE的方法从‘翠冠’梨（Pyrus pyrifolia Nakai．cv‘Cuiguan’）叶片中克隆到四种铁蛋白基因的全长序列。这四种基因已被GenBank数据库收录，登录号分别为DQ417207、DQ417208、DQ417209、DQ417210。第一种梨铁蛋白基因PpFer1的全长为795bp，编码265个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有292bp的3’端尾随序列区；第二种梨铁蛋白基因

论文目录

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• 目录
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• 缩略词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 铁蛋白的结构
• 2 铁蛋白基因的种类
• 3 铁蛋白的分布
• 4 植物铁蛋白的功能
• 4.1 铁蛋白在植物铁平衡中的作用
• 4.2 铁蛋白在植物发育中的作用
• 4.3 铁蛋白在植物对胁迫反应中的作用
• 4.3.1 铁蛋白是一种普遍存在的胁迫反应蛋白
• 4.3.2 铁蛋白与生物胁迫
• 4.3.3 铁蛋白与非生物胁迫
• 5 植物铁蛋白的合成调节
• 6 铁蛋白基因的克隆
• 7 铁蛋白的转基因应用
• 7.1 粮食作物的转基因应用
• 7.2 园艺作物的转基因应用
• 7.3 其它植物
• 8 结语
• 第二章 苹果铁蛋白基因和启动子的克隆及表达特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA的提取
• 1.2.2 DNA的检测与定量
• 1.2.3 总RNA的提取
• 1.2.4 总RNA中DNA的消化
• 1.2.5 基因保守片段的克隆
• 1.2.6 3'RACE
• 1.2.7 5'RACE
• 1.2.8 Southern blotting检测
• 1.2.9 RT-PCR定量检测
• 1.2.10 启动子的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 苹果ferritin基因的克隆
• 2.1.1 苹果ferritin基因保守片段的克隆
• 2.1.2 3'RACE
• 2.1.3 5'RACE
• 2.1.4 苹果ferritin基因全长cDNA的克隆
• 2.1.5 苹果ferritin基因组序列及特征分析
• 2.1.6 氨基酸序列的同源性分析
• 2.1.7 基因组DNA的Southern blotting分析
• 2.2 苹果铁蛋白基因的表达特性
• 2.3 苹果铁蛋白基因启动子的克隆
• 2.3.1 基因组DNA的酶切
• 2.3.2 启动子目的条带的扩增
• 2.3.3 启动子序列的分析
• 3 讨论
• 第三章 梨铁蛋白基因和启动子的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA的提取
• 1.2.2 DNA的检测与定量
• 1.2.3 总RNA的提取
• 1.2.4 总RNA中DNA的消化
• 1.2.5 ferritin基因保守片段的克隆
• 1.2.6 3'RACE
• 1.2.7 5'RACE
• 1.2.8 Southern blotting检测
• 1.2.9 启动子的克隆
• 2 结果与分析
• 2.1 梨ferritin基因保守片段的克隆
• 2.2 3'RACE
• 2.3 5'RACE
• 2.4 梨ferritin基因全长cDNA的克隆
• 2.5 梨铁蛋白基因组序列及特征分析
• 2.6 氨基酸序列的同源性分析
• 2.7 基因组DNA的Southern杂交分析
• 2.8 启动子目的条带的扩增
• 2.9 启动子序列的分析
• 3 讨论
• 第四章 超声波介导菜豆铁蛋白基因转化苹果的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒DNA
• 1.3 化学试剂和仪器
• 1.4 质粒的DNA提取
• 1.5 超声波转化
• 1.6 转化愈伤组织的筛选
• 1.7 PCR扩增目标DNA
• 1.8 Southern blotting检测
• 1.9 RT-PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 超声强度和时间对转化的影响
• 2.2 转菜豆铁蛋白基因苹果植株的获得
• 2.3 PCR检测
• 2.4 基因组DNA的酶切
• 2.5 Southern blotting检测
• 2.6 RT-PCR检测
• 3 讨论
• 第五章 转菜豆铁蛋白基因的苹果植株的分子鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 化学试剂
• 1.3 转基因株系和非转基因株系继代所用的培养基
• 1.4 菌种和质粒
• 1.5 质粒的DNA提取
• 1.6 PCR检测
• 1.7 PCR-Southern杂交检测
• 1.8 Southern blotting检测
• 1.9 RT-PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR检测
• 2.2 PCR-Southern blotting检测
• 2.3 基因组DNA的酶切
• 2.4 Southern blotting检测
• 2.5 RT-PCR检测
• 3 讨论
• 第六章 铁蛋白基因在转基因苹果基因组中的表达特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 总DNA和RNA的提取
• 1.2.2 荧光定量RT-PCR检测
• 1.2.3 外源铁蛋白基因在不同转基因株系茎段中的转录表达检测
• 1.2.4 铁蛋白基因的铁诱导转录表达检测
• 1.2.5 铁蛋白基因在转基因植株不同部位的转录表达检测
• 2 结果与分析
• 2.1 转基因植株基因组中外源铁蛋白基因的表达检测
• 2.1.1 RT-PCR产物特异性检验
• 2.1.2 标准曲线的绘制
• 2.1.3 外源菜豆铁蛋白基因cDNA相对定量
• 2.2 在铁诱导条件下的铁蛋白基因的转录表达特性
• 2.3 铁蛋白基因在转基因植株不同部位的转录表达特性
• 3 讨论
• 第七章 转菜豆铁蛋白基因番茄植株的分子鉴定及表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 化学试剂
• 1.3 菌种和质粒
• 1.4 转化植株的分子鉴定
• 1.4.1 转基因番茄植株的PCR检测
• 1.4.2 PCR-Southern blotting检测
• 1.4.3 Southern blotting检测
• 1.4.4 RT-PCR检测
• 1.5 转基因植株铁、锌、锰含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR检测
• 2.2 PCR-Southern blotting检测
• 2.3 Southern blotting检测
• 2.4 RT-PCR检测
• 2.5 转基因番茄组织中的铁、锌、锰含量的变化
• 3 讨论
• 全文讨论
• 1 苹果、梨铁蛋白基因的序列比较和功能预测
• 1.1 铁蛋白基因的克隆
• 1.2 铁蛋白基因的序列比较与功能预测
• 1.3 铁蛋白基因启动子的克隆
• 2 在转基因植株中影响铁蛋白基因表达的因素
• 2.1 转化方法对外源基因表达的影响
• 2.2 外源基因插入的拷贝数与表达的关系
• 2.3 外源基因和内源基因的同源性与表达的关系
• 2.4 外源基因的铁诱导表达特性
• 2.5 启动子对铁蛋白基因表达的影响
• 2.6 不同种类铁蛋白基因的表达特性
• 3 今后进一步研究方向
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士期间发表论文
• 致谢