治疗严重脓毒症创新药物——活化C蛋白样物质的开发

论文题目: 治疗严重脓毒症创新药物——活化C蛋白样物质的开发

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物与生化药学

作者: 冯军

导师: 赵文杰

关键词: 脓毒症,活化蛋白,活化蛋白样物质,蛇毒,脂多糖,聚乙二醇化

文献来源: 上海医药工业研究院

发表年度: 2005

论文摘要: 脓毒症是导致人类死亡的一常见病种,它有极高的发病率和死亡率。尽管重症抢救的技术不断进步,但是脓毒症患者的死亡率却一直维持在30-50%之间。脓毒症所带来的经济负担是相当大的,在美国每年仍约有750,000位脓毒症新增病人,其中至少有225,000位病人当年死亡,每个病人所增加的医疗费用约为22800美元。脓毒症的发病机理主要包括引发炎症的各种细胞因子的释放、扩散性血管内皮细胞的受损、器官衰竭引起机体继发性的促凝血因子的释放。自20世纪80年代以来,随着对脓毒症发病机制研究的深入,开发各种旨在从不同阶段抑制脓毒症形成的药物也随即兴起,并进行了80多项临床试验,但是遗憾的是仅有一个药物（活化C蛋白）被开发成功。2001年11月21日重组的人活化C蛋白（商品名为:Xigris）被FDA批准在美国上市,随后又在澳大利亚、德国、法国等发达国家获准上市,多项临床试验证明活化C蛋白能显著降低脓毒症病人的死亡率。蛇毒是一种混合物,它含有许多种类具有不同生物活性的蛋白质,其中很多蛋白质作用于人血液系统的成分。这些蛇毒组分根据其作用于血液系统成分的不同又被分为若干种类,如使纤维蛋白原凝固的酶类（蛇毒类凝血酶和蛇毒凝血酶）、C蛋白激活剂、凝血酶原激活剂、凝血因子V激活剂、凝血因子X激活剂、血小板聚集抑制因子、凝血酶抑制剂等。基于活化C蛋白被成功开发为治疗严重脓毒症药物和蛇毒中存在多种作用于血液系统的组分,我们提出从蛇毒中寻找具有同活化C蛋白功能相似的蛋白质（活化C蛋白样物质）,进行治疗脓毒症创新药物的开发。运用活化部分凝血活酶时间和显色肽发色试验分别考察活化C蛋白所具有的抗凝活性和特定的酰胺酶活性,综合二者的活性从8种国产蛇毒中筛选活化C蛋白样物质,结果表明在蝮蛇毒中可能存在具有较强活性的活化C蛋白样物质。使用阴离子交换和凝胶过滤层析技术对蝮蛇毒进行分离纯化,结果得到一个能显著延长人血浆活化部分凝血活酶时间和具有较强水解活化C蛋白特异显色肽能力的蛋白质,SDS-PAGE和凝胶过滤层析纯度检测试验表明该蛋白为单一组分,这表明蝮蛇毒中确实存在着活化C蛋白样物质。SDS-PAGE法测得其分子量为15.3 kD,等电聚焦法测得其等电点约为4.80,酶学动力学研究表明其水解显色肽的Km值为3.16×10（-5） mol·L-1,Vmax值为1.16×10-4 mol·L（-1）·min（-1）。采用静脉注射脂多糖的方式,建立脓毒症小鼠实验动物模型。以降低脓毒症小鼠实验动物的死亡率作为判断指标,考察活化C蛋白样物质治疗脓毒症的效果,结果发现上海医药工业研究院博士学位论文活化C蛋白样物质能显著降低脓毒症小鼠实验动物的死亡率,预示着该蛋白质可能具有同活化的C蛋白类似的治疗脓毒症的临床效果。基于活化C蛋白样物质是来源于蛇毒的蛋白质,作为药物进行开发存在着有免疫原性和稳定性差的缺点,采用活化的聚乙二醇试剂对活化C蛋白样物质进行化学修饰,得到了聚乙二醇化活化C蛋白样物质。修饰后的活化C蛋白样物质的生物活性得到了较高保留,而免疫原性被大大降低,稳定性得到了提高。关键词:脓毒症蛇毒活化C蛋白脂多糖活化C蛋白样物质聚乙二醇化

论文目录:

缩写与中英文对照

摘要

ABSTRACT

第一章前言

1.1 脓毒症

1.2 活化C蛋白

1.2.1 C蛋白和活化C蛋白

1.2.2 活化C蛋白的生物学效应

1.2.2.1 活化C蛋白的抗凝溶栓作用

1.2.2.2 活化C蛋白的抗炎作用

1.2.2.3 寸内皮细胞的调控作用

1.2.2.4 活化C蛋白对严重脓毒症的治疗

1.2.3 活化C蛋白及其相关产品的开发

1.2.3.1 活化C蛋白

1.2.3.2 人体内活化C蛋白水平的诊断

1.2.3.3 血栓调节蛋白和内皮细胞C蛋白受体

1.3 来源于蛇毒的作用于血液系统的蛋白质

1.3.1 蛇毒类凝血酶

1.3.1.1 理化性质

1.3.1.2 临床应用

1.3.2 蛇毒凝血酶

1.3.3 蛇毒C蛋白激活剂

1.3.4 蛇毒凝血酶原激活剂

1.3.5 蛇毒凝血因子V激活剂

1.3.6 蛇毒凝血因子X激活剂

1.3.7 蛇毒血小板聚集抑制因子

1.3.8 凝血酶抑制剂

1.3.9 蛇毒纤溶酶原激活剂

1.4 本课题的立题意义和研究内容

1.4.1 立题意义

1.4.2 研究内容

第二章在不同蛇毒中筛选活化C蛋白样物质的研究

2.1 材料

2.1.1 蛇毒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器和设备

2.2 试验方法

2.2.1 活化部分凝血活酶时间的测定

2.2.2 蛇毒水解显色肽能力的测定

2.3 试验结果

2.3.1 不同蛇毒对人血浆活化部分凝血活酶时间的影响

2.3.2 不同蛇毒对活化C蛋白特异显色肽水解的能力

2.4 讨论

2.5 小结

第三章蝮蛇毒中活化C蛋白样物质的分离纯化及其特性的研究

3.1 材料

3.1.1 蛇毒

3.1.2 层析填料

3.1.3 主要生化试剂

3.1.4 主要仪器和设备

3.2 试验方法

3.2.1 阴离子交换层析分离蝮蛇毒

3.2.2 凝胶过滤层析

3.2.3 延长活化部分凝血活酶时间的测定

3.2.4 水解显色肽能力的测定

3.2.5 精氨酸酯酶活性的测定

3.2.6 胆碱酯酶

3.2.7 蛋白水解酶

3.2.8 L-氨基酸氧化酶

3.2.9 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

3.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3.2.10.1 制备分离胶及浓缩胶

3.2.10.2 样品的处理与上样

3.2.10.3 电泳

3.2.10.4 固定、染色、脱色

3.2.11 等电聚焦电泳法(IEF)测定蛋白质的等电点

3.2.11.1 凝胶液的配制

3.2.11.2 装管及聚合

3.2.11.3 电泳

3.2.11.4 剥胶

3.2.11.5 固定及染色

3.2.12 HPLC检测纯度

3.2.13 凝胶过滤预装柱检测纯度

3.2.14 酶促反应中Km禾Vmax的测定

3.3 结果

3.3.1 阴离子交换层析

3.3.2 活化部分凝血活酶时间的测定

3.3.3 水解显色肽能力的测定

3.3.4 凝胶过滤层析纯化

3.3.5 SDS-PAGE纯度检测

3.3.6 凝胶过滤预装柱检测纯度

3.3.7 HPLC检测纯度

3.3.8 分子量测定

3.3.9 等电点测定

3.3.10 其它几种酶活性的检测

3.3.11 蛋白酶抑制剂对酶促反应的影响

3.3.12 酶促反应中Km和Vmax的测定

3.4 讨论

3.5 小结

第四章活化C蛋白样物质对脓毒症试验动物的作用

4.1 材料

4.1.1 实验动物

4.1.2 主要试剂

4.2 试验方法

4.2.1 LPS对小鼠LD100的测定

4.2.2 在增敏剂作用下LPS对小鼠LD100的测定

4.2.3 APCL对正常小鼠毒性测定

4.2.4 APCL降低脓毒症小鼠死亡率的考察

4.3 结果

4.3.1 LPS对小鼠LD100的测定

4.3.2 在放线菌素D增敏作用下LPS对小鼠LD100的测定

4.3.3 APCL对正常小鼠毒性测定

4.3.4 APCL降低脓毒症小鼠死亡率

4.4 讨论

4.5 小结

第五章活化C蛋白样物质的聚乙二醇修饰

5.1 材料

5.1.1 层析填料

5.1.2 主要仪器设备

5.1.3 主要试剂

5.2 试验方法

5.2.1 APCL与mPEG-SPA(MW5000)的反应

5.2.2 聚乙二醇化APCL的分离纯化

5.2.3 SDS-PAGE分析聚乙二醇化APCL

5.2.4 凝胶过滤预装柱分析聚乙二醇化APCL

5.2.5 HPLC分析聚乙二醇化APCL

5.2.6 延长活化部分凝血活酶时间的测定

5.2.7 水解显色肽能力的测定

5.2.8 稳定性比较试验

5.2.9 双向琼脂扩散试验

5.3 结果

5.3.1 聚乙二醇化APCL的分离纯化

5.3.2 SDS-PAGE分析聚乙二醇化APCL

5.3.3 凝胶过滤预装柱分析聚乙二醇化APCL

5.3.4 HPLC分析聚乙二醇化APCL

5.3.5 延长活化部分凝血活酶时间的测定

5.3.6 水解显色肽能力的测定

5.3.7 稳定性比较试验

5.3.8 双向琼脂扩散试验

5.4 讨论

5.5 小结

结论

展望

参考文献：

致谢

综述报告和发表论文

发布时间: 2005-05-20

参考文献

[1].抗脓毒症中药血必净注射液苯酞类成分药代动力学研究[D]. 张纳婷.中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)2018

治疗严重脓毒症创新药物——活化C蛋白样物质的开发

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