论文摘要
层孔菌是属于多孔菌科的一类真菌。在我国民间许多层孔菌（如裂蹄层孔菌,木蹄层孔菌,松针层孔菌等）历来作为药用,广泛用于治疗胃肠道疾病,胃溃疡,炎症,淋巴性疾病以及胃癌、肝癌、结肠癌等多种癌症。但是古代医书和民间药方对这些层孔菌的描述比较笼统,缺乏药效成分、功能定位和作用机理的阐述,并且由于野生环境不断受到破坏,导致这些药用真菌资源锐减,许多品种已濒临灭绝,很难人工采集到。因此如何保护药用真菌这一资源,并利用现代生物技术深入发展和利用药用真菌,已成为中药现代化的一个主要研究方向。本论文针对目前药用真菌野生资源缺乏,作用机理不明这两个困扰药用真菌新药创制的主要问题,以层孔菌作为研究对象,通过构建木蹄层孔菌L8的液体深层发酵工艺,解决了人工资源化问题,为深入进行层孔菌药用真菌的新药材研制提供了一种模式;进一步分析了层孔菌抗肿瘤功效的物质基础,确定多酚化合物Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分;在此基础上,深入研究了Hispolon的抗肿瘤分子机制,发现Hispolon可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的活性氧自由基（ROS）介导的线粒体途径的凋亡,这种凋亡机制至今尚未报道。主要结果如下:1.通过形态学,生理生化特征,以及ITS序列分析,对实验室前期分离到的层孔菌L8菌株进行了鉴定,确定其为木蹄层孔菌（GeneBank no.DQ 513402）。在明确菌种后,通过反复实验,构建了木蹄层孔菌L8的液体深层发酵培养方法,并优化了其发酵工艺。结果表明当发酵培养基组成为:葡萄糖5%,蚕蛹水解液1%,酵母粉0.5%,KH2PO40.05%,MgSOO4 0.05%;发酵条件为:温度25℃,初始pH 5.0,转速100 rpm,通气量1.0 vvm,接种体积10%（v/v）,发酵周期6天时,层孔菌L8的菌丝生物量最大,可达18.11±1.08 g/L,是优化前的2.3倍。2.对层孔菌L8的发酵菌粉进行了动物药效学实验,结果表明层孔菌L8的发酵菌粉在剂量为1.5g/kg时对小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用,和阴性对照组相比,平均抑瘤率为23.5%（P＜0.05）;进一步发现该剂量给药组的荷瘤鼠的平均胸腺重量为68.5 mg,显著大于阴性对照组的57.5 mg（P＜0.05）,而该剂量组荷瘤鼠的平均肝脏重量为230.1 mg,同阴性对照组相当（239.7 mg）;相比之下,阳性对照组1.25mg/kg顺铂的抑瘤率虽然高达64.7%,但是同阴性对照组相比,顺铂处理后,荷瘤鼠的胸腺和脾脏的重量都显著下降。另外从给药前后荷瘤鼠的体重变化也可以看出,层孔菌L8的发酵菌粉给药后,荷瘤鼠的体重比给药前都有所增加。以上结果表明层孔菌L8的发酵菌粉,在肿瘤治疗方面,具有潜在的开发价值。3.采用体外人源的肿瘤细胞作为筛选模型,对10余种层孔菌进行了抗肿瘤活性评价和活性成分的分析,结果发现Hispolon为一些层孔菌中共有的一个活性成分,并发现Hispolon对许多肿瘤细胞表现出剂量依赖性的生长抑制作用,其中对胃癌细胞SGC-7901的活性较好,作用72 h后的IC50低于10μg/mL。4.利用动态荧光可视技术,流式细胞术,Western-blot等现代肿瘤细胞学和分子药理学的技术和方法,深入研究了Hispolon诱导胃癌细胞死亡的分子机理。结果发现Hispolon可以诱导胃癌细胞发生一种特殊的ROS介导的线粒体途径的凋亡。该凋亡机制如下所述:Hispolon通过将细胞内的GSH驱逐出细胞外,使得细胞内的GSH含量下降;同时抑制细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶GPX的活性,使得胃癌细胞的抗氧化能力大大下降,从而导致ROS的急剧增加。大量的ROS积聚引起了线粒体膜的氧化损伤,破坏了线粒体膜的完整性,导致线粒体膜的通透性增加,使得线粒体中的细胞色素C大量释放出来,激活了Caspase的级联反应,启动凋亡程序,最终引发细胞发生凋亡。相比之下,当Hispolon作用正常的胃粘膜上皮细胞后,ROS并没有显著增加,细胞也没有发生明显的死亡。探索造成这种差异的原因时,我们发现胃癌细胞本身固有的ROS水平比正常的胃上皮细胞要高,这使得胃癌细胞对Hispolon更加敏感。因为胃癌细胞依靠GSH来清除过多的ROS,当Hispolon作用之后,GSH抗氧化系统受到了破坏,严重影响了细胞的抗氧化能力,导致大量的ROS增加,引发了细胞死亡;相比之下,由于正常胃上皮细胞本身固有的ROS水平比较低,当Hispolon作用后,ROS并没有显著增加,其氧化压力处于细胞所能承受的范围之内,因而细胞没有发生死亡。5.低剂量的Hispolon（2.5μg/mL）可以显著地增加化疗药物（丝裂霉素C,5-氟尿嘧啶,阿霉素）对胃癌细胞SGC-7901的杀伤性。并且这种增敏机制是通过引发胃癌细胞中的GSH急剧下降,导致了ROS的大量积聚,进而引发了细胞死亡。综上所述,本论文的研究结果为解决层孔菌类药用真菌的人工资源化问题,深入研究其活性成分的作用机制提供了一种思路和方法,并为层孔菌类药用真菌的新药创制提供了一定的依据。