抗TNF-α和IL-1βIgY抗体抗豚鼠过敏性支气管哮喘的实验研究

论文摘要

目的:探讨抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入表面用药治疗过敏性支气管哮喘的作用机制。方法:应用卵清白蛋白雾化吸入法建立稳定的Hartley豚鼠过敏性支气管哮喘模型,随机分为四组:正常对照组（A组）;过敏性支气管哮喘模型组（B组）;0.1%抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入治疗组（C组）;1.0%的抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入治疗组（D组）。肉眼观察各组动物饮食、活动、抓鼻、咳嗽、喷嚏等过敏行为变化;并于治疗后2h、4h、8h、24h处死各组动物,观察肺色泽、大小等;取右肺肺尖、肺体、肺底做病理切片HE染色观察肺泡上皮细胞、肺泡壁结构、毛细血管密度、形态、管腔通畅及粘膜水肿情况、支气管周围浸润的炎性细胞种类、数量以及肺泡腔内容物情况;使用生理盐水对左肺行支气管肺泡灌洗,收集支气管肺泡灌洗液（BALF）,离心后取沉淀细胞做细胞涂片,Wright’s染色计数嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等;以Lowrys法测量BALF上清液中总蛋白含量。用双抗夹心ELISA法测定上清液中TNF-α、IL-1、IL-4、IL-8、IL-10、IL-13、细胞因子含量。统计各时间点、各组细胞因子与总蛋白之间的比值数据。结果:行为学变化:抗TNF-α和IL-1βIgY抗体治疗组豚鼠行为、活动、饮食等于治疗三天后基本趋于正常。肺组织病理生理学改变:A组各时间点的肺组织光镜可见肺泡管和肺泡壁结构完整,肺泡腔内清洁透亮,肺泡上皮细胞排列有序,与毛细血管及其他间质成份构成完整的肺泡呼吸膜;肺泡壁毛细血管密集,管腔通畅,可见形态规则的红细胞游于其中。B组各时间点的肺组织光镜可见肺泡管和肺泡壁结构受损,满视野肺泡腔内充满渗出液,可见坏死脱落的肺泡上皮细胞和渗出的白细胞;肺间质水肿、炎性细胞浸润致肺泡壁增厚、肺泡壁毛细血管扭曲或扩张淤血,并伴有白细胞嵌塞和红细胞淤积,有效血流的毛细血管显著减少。C组和D组经不同浓度的抗TNF-α和IL-1β抗体雾化吸入治疗后肺泡管和肺泡壁结构受损程度轻于B组,肺泡腔内偶见有极少量炎症细胞游于其中,支气管管腔及肺泡中粘稠的粘液栓较B组明显减少且支气管管腔较为规则,周围少见炎性细胞浸润,支气管粘膜上皮修复现象明显。C、D组间未见有显著区别。肺灌洗液细胞学变化:与B组相比,C组肺灌洗液中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数量较哮喘模型组显著下降（2h、4h、8h,P＜0.05）;巨噬细胞显著上升（2 h、4 h、8 h,P＜0.05）。D组肺灌洗液中嗜酸性粒细胞数量较B组显著下降（2 h、4 h、8 h,P＜0.05）,中性粒细胞数量也显著低于B组（2 h、8 h,P＜0.05）,淋巴细胞含量较哮喘模型组显著下降（2 h、8 h、24 h,P＜0.05）,巨噬细胞显著上升（2 h、8 h,P＜0.05）。细胞因子含量变化:与B组相比,C组和D组在治疗2h后BALF每微克总蛋白（μg）中的IL-1含量（pg）明显降低（B组:0.040±0.014,C组:0.013±0.001,D组:0.019±0.006）,IL-8含量明显降低（B组:0.162±0.192,C组:0.015±0.001,D组0.025±0.007）,而IL-4含量仅在C组明显降低（B组:0.104±0.011,C组:0.052±0.036）。治疗4h后与B组相比,C组IL-1含量降低（B组:0.023±0.007,C组:0.015±0.002）,IL-4含量降低（B组:0.094±0.046,C组0.076±0.055）,IL-8含量降低（B组:0.028±0.009,C组:0.017±0.003）,IL-13含量降低（B组:0.030±0.010,C组:0.018±0.009）,TNF-α含量降低（B组:0.072±0.012,C组:0.063±0.035）,而IL-10明显低于D组（B组:0.242±0.102,D组:0.337±0.103）。治疗8h后与B组相比,C组IL-10含量显著升高（B组:0.402±0.098,C组2.846±0.445,P＜0.05）,D组IL-10含量也有所升高（D组0.497±0.289）,D组TNF-α降低（B组:0.100±0.019,D组0.084±0.014）。治疗24h后与B组相比,C组IL-1含量明显降低（B组:0.028±0.012,C组:0.011±0.005）,IL-4含量明显降低（B组:0.181±0.086,C组0.070±0.010）,IL-8含量降低（B组:0.027±0.005,C组:0.018±0.006）,IL-13含量明显降低（B组:0.034±0.010,C组:0.017±0.004）,TNF-α含量降低（B组:0.102±0.034,C组:0.077±0.029）;D组IL-10含量明显升高（B组:0.365±0.247,D组0.765±0.264）,TNF-α含量降低（B组:0.102±0.034,D组0.088±0.020）。8h后C组与B组IL-10含量与IL-1含量的比值（42.75:19.14）、与IL-4含量的比值（5.16:2.73）、与IL-8含量的比值（36.49:16.08）、与IL-13含量的比值（23.92:10.58）、与TNF-α的含量比值（4.87:4.02）显著或明显升高;8h后D组与B组仅IL-10含量与TNF-α含量的比值稍高（5.92:4.02）。24h后C组与B组IL-10含量与IL-1含量的比值（25.64:13.04）、与IL-4含量的比值（4.03:2.02）、与IL-8含量的比值（15.67:13.52）、与IL-13含量的比值（16.59:10.74）显著或明显升高;24h后D组与B组IL-10含量与IL-1含量的比值（14.17:13.04）、与IL-4含量的比值（3.12:2.02）、与IL-8含量的比值（15.30:13.52）、与IL-13含量的比值（21.25:10.74）、与TNF-α含量的比值（8.69:3.58）显著或明显升高。结论:本实验从动物整体行为表现、炎症病理组织切片观察、炎性细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞）以及炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-8、IL-13）和抗炎细胞因子（IL-10）在BALF中的含量变化的研究,初步探讨了前炎性细胞因子在过敏性支气管哮喘中的作用及与其他细胞因子的相互关系,以及不同浓度的抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入治疗过敏性支气管哮喘模型豚鼠中的作用机制,并初步证明TNF-α和IL-1β在过敏性支气管哮喘中起着关键作用,是炎性细胞因子网的启动因子,加速和加强因子,以及组织损伤因子。抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入治疗模型豚鼠过敏性支气管哮喘能够明显减轻模型豚鼠过敏性支气管哮喘的症状及炎症病理改变的严重程度,同时显著或明显地减少BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞,降低IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-8、IL-13含量、提高IL-10/IL-1β、IL-10/TNF-α、IL-10/IL-4、IL-10/IL-8、IL-10/IL-13的比值,增加IL-10含量,从而减轻过敏性支气管哮喘的症状和体征。本研究使用抗TNF-α和IL-1βIgY抗体雾化吸入方法研究治疗模型豚鼠过敏性支气管哮喘,其结果提示抗TNF-α和IL-1βIgY抗体局部被动免疫治疗过敏性炎症是一个前景十分光明的发展方向。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第三章 结果
• 3.1 动物的存活率
• 3.2 各组动物行为学观察
• 3.3 肺组织病理形态学 HE染色结果
• 3.4 BALF中细胞含量变化
• 3.5 BALF中各时段、各类细胞因子水平比较
• 第四章 讨论
• 4.1 动物死亡率及行为学变化
• 4.2 各组动物病理生理学改变
• 4.3 支气管、肺泡渗出液炎性细胞与过敏性支气管哮喘
• 4.4 细胞因子与过敏性支气管哮喘
• 4.4.1 TNF-α和IL-1β与过敏性支气管哮
• 4.4.2 IL-4、IL-10与过敏性支气管哮喘
• 4.4.3 IL-8与过敏性支气管哮喘
• 4.4.4 IL-13与过敏性支气管哮喘
• 第五章 结论和展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A-图片
• 附录B-综述
• 攻读学位期间的研究成果