论文摘要
目的:通过XIAP反义寡脱氧核苷酸（ASODN）转染喉癌Hep-2细胞株探讨对Hep-2细胞株增殖、凋亡、及化疗敏感性的影响。方法:首先在37℃,5﹪CO2 ,20﹪O2和95﹪湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞,取指数生长期细胞,分别用于以下各步实验。1反义寡脱氧核苷酸转染Hep-2细胞转染率的测定:取对数生长期细胞进行转染,用脂质体瞬时转染法分别介导4个浓度梯度的XIAP反义寡脱氧核苷酸100,200,400,600nmol进入细胞。取转染后6小时细胞于荧光倒置显微镜下观察。2 MTT法检测不同浓度顺铂作用Hep-2细胞24小时后对细胞增殖的抑制情况,RT-PCR、流式细胞术检测顺铂作用Hep-2细胞24小时后细胞凋亡以及XIAP mRNA、XIAP蛋白的表达情况。3 MTT法检测基因转染前后联合顺铂作用对Hep-2细胞增殖的抑制情况:取对数生长期Hep-2细胞进行转染,将实验分成以下几组:Ⅰ组:以无血清RPMI 1640培养基代替转染复合物作为空白对照;Ⅱ组:脂质体对照组;Ⅲ组:转染ASODN组,设四个浓度100、200、400、600nmol/ml;Ⅳ组:转染SCODN组,设四个浓度100、200、400、600 nmol/ml;以上四组又分为3ug/ml顺铂（DDP）作用组及无顺铂组,每组设3个平行孔,置37℃,5﹪CO2, 20﹪O2培养箱中孵育18h-24h至细胞85﹪-90﹪汇板进行转染,加化疗药组于转染后6小时加入DDP使其终浓度为3ug/ml,继续培养。分别于转染后12、24、36、48小时,在培养细胞中加入MTT （5mg/ml） 20μl/孔,继续孵育4h后小心去除原孔内培养液,加入甲臢溶解液（SDS溶液）100μl/孔,放于振荡器连续振荡10min后于酶标仪中检测光密度（OD）值。4 RT-PCR法检测基因转染前后联合顺铂作用XIAP mRNA的表达情况:取对数生长期Hep-2细胞进行转染,将实验分成四组,Ⅰ组:空白对照组;Ⅱ组:脂质体对照组;Ⅲ组:200nmol/L ASODN转染组;Ⅳ组:200nmol/L SCODN转染组;以上四组又分为3ug/ml DDP作用组及无DDP组,每组设3个平行孔,基因转染后36小时收集1×107个细胞,采用Trizol法提取总RNA。分别取等量RNA采用20ul反应体系按照cDNA试剂盒说明进行逆转录,然后取5ul逆转录反应产物为模板进行PCR扩增。将PCR产物以1.5﹪琼脂糖凝胶电泳,紫外线灯下观察并照相。5流式细胞仪检测基因转染前后联合顺铂作用对细胞凋亡率及XIAP蛋白表达的影响。实验分组同RT-PCR,每组设3个平行孔。取对数生长期Hep-2细胞进行基因转染,转染后置37℃, 5﹪CO2,20﹪O2培养箱中孵育至36小时,收获细胞制备单细胞悬液,送流式细胞仪检测。结果:1 XIAP反义寡核苷酸转染Hep-2的转染情况及细胞形态学改变在荧光倒置显微镜下观察发现各浓度的反义寡核苷酸（100nmol/l-600nmol/l）实验组Hep-2细胞形态有不同程度的改变,表现为细胞体积变小,形态不规则,细胞皱缩,核固缩,胞浆粗糙和分裂相少见等。而正常对照Hep-2细胞形态完整,贴壁生长良好。各浓度带FITC标记的XIAP反义寡核苷酸转染细胞后6小时于荧光显微镜下观察均可见绿色荧光,荧光分布主要积聚于细胞核内,同时细胞浆中也有较强的荧光分布。其平均转染效率在终浓度为100nmol/L、200nmol/L、400nmol/L、600nmol/L分别为（95±2.1）﹪、（98±1.3）﹪、（96±2.6）﹪、（93±3.0）﹪,方差分析显示组间差异无统计学意义（P>0.05）;而对照组未见转染现象。（见Fig.1）2不同浓度的顺铂（1ug/ml～5ug/ml）作用24小时后均对细胞增殖有抑制作用,并随剂量的增加抑制率逐渐增大（P<0.05）,细胞抑制率在3ug/ml时明显增加,以5ug/mlDDP组抑制率最大（16.72±0.81）﹪,2ug/mlDDP组与3ug/mlDDP组有极显著统计学差异（P<0.01）。细胞凋亡率随DDP剂量的增加而逐渐增大（P<0.05）,以5ug/mlDDP组凋亡率最大（11.38±0.42）﹪,2ug/mlDDP组与3ug/mlDDP组有极显著统计学差异（P<0.01）。XIAP蛋白荧光指数（FI）随化疗剂量的增加逐渐降低（P<0.05）。随着细胞凋亡率增加的同时XIAP的蛋白表达荧光指数水平逐渐下调,细胞凋亡率的变化与XIAP蛋白荧光指数（FI）呈显著负相关（r=-0.984,P<0.01）。我们选用3ug/ml DDP用于后续实验。3 MTT法检测Hep-2细胞转染ASODN前后联合顺铂作用对细胞增殖抑制的影响结果显示不同浓度的XIAP ASODN （ 100nmol/L- 600nmol/L）转染Hep-2细胞后均对细胞增殖有抑制作用,并呈时间和剂量的依赖性,各时段及各浓度的XIAP ASODN与3ug/mlDDP联合作用对细胞的生长抑制率显著高于单用XIAP ASODN组和单用DDP组,差异均有显著性意义（P<<0.05）。4 XIAP反义寡核苷酸对顺铂诱导Hep-2细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果显示ASODN+DDP组凋亡率与单纯DDP组相比细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;而SCODN转染组细胞凋亡率与空白对照组相比没有显著性差异（P >0.05）,SCODN转染+DDP组与单纯DDP组细胞凋亡率也没有统计学差异（P >0.05）。5 RT-PCR检测XIAP反义寡核苷酸联合顺铂作用对Hep-2细胞中XIAP mRNA的影响结果显示PCR扩增产物约为802bp大小的特异性条带,ASODN组较空白对照组、脂质体对照组、SCODN对照组相比,XIAP扩增条带的亮度明显降低。说明200nmol/L ASODN作用于Hep-2细胞36小时后,XIAP mRNA的表达下调,ASODN+DDP组XIAP mRNA的表达明显下调,而对照组和SCODN组XIAP mRNA水平无明显变化。6 XIAP反义寡核苷酸对顺铂作用前后Hep-2细胞XIAP蛋白表达的影响结果显示ASODN治疗组的XIAP蛋白荧光指数明显低于空白对照组、脂质体转染组以及SCODN转染组（P <0.05）,ASODN转染+DDP组比单纯DDP组荧光指数明显降低（P<0.01）,SCODN转染+DDP组与单纯DDP组XIAP蛋白荧光指数没有统计学差异（P >0.05）。Pearson相关分析显示:在不同处理组与对照组中细胞凋亡率的变化与XIAP蛋白荧光指数的变化呈负相关（r=-0.976,P<0.01）。结论: XIAP反义寡核苷酸转染Hep—2细胞株能够抑制Hep—2细胞株增殖,促进细胞的凋亡并能提高其对化疗的敏感性。