冬凌草质量控制与二萜类成分药物代谢动力学研究

论文摘要

冬凌草为唇形科香茶菜属植物碎米桠（Isodon rubescens（Hemsl.） Hara）的干燥地上部分,以草质部分入药。广泛分布于我国黄河长江流域,主产于河南济源太行山一带。味甘苦,性微寒,具有清热解毒、消炎止痛、健胃活血及抗肿瘤之功效。民间常常用于治疗咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤,并对食管癌、贲门癌、原发性肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌等有一定疗效,对食管上皮增生有显著疗效。植物研究证实冬凌草含有二萜、黄酮、酚酸、三萜和挥发油等化学成分。目前已有冬凌草用于抗癌的片剂和治疗咽痛的含片应用于临床。二萜是冬凌草中一种主要的药效活性成分,但由于种类多样且含量较低,使其深入研究受到限制。然而对于冬凌草的大量研究仅处在提取分离阶段,而对其质量控制方法和药物代谢动力学方面的研究却很少。本文通过对冬凌草进行系统分离,确定其中的化学成分,采用LC-MS作为主要分析方法,利用其快速高效、灵敏度高、特异性强的特点,对冬凌草中的微量和痕量物质进行定性和定量分析,并推断其中的未知成分。同时研究二萜类成分在动物体内的过程和代谢规律研究,为进一步开发利用二萜类有效成分提供技术支持。第一部分冬凌草化学成分的研究目的:本研究以冬凌草乙酸乙酯和正丁醇部分为研究对象,利用硅胶柱色谱、制备薄层色谱、高效液相制备色谱以及重结晶等分离纯化技术对其进行系统分离研究,并应用MS、1H-NMR、（13）C-NMR现代化手段完成单体化合物分子的结构鉴定,为进一步开发利用提供依据。方法:干燥的冬凌草（10 Kg）适当粉碎后,用95%乙醇冷浸3次,合并浸出液加热,加入活性炭趁热抽滤,滤液减压浓缩至粘膏状（340 g）,将其悬浮于饱和NaCl水溶液中,分别用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取,继而得到石油醚部位（8 g）、三氯甲烷部位（32 g）和乙酸乙酯部位（48 g）、正丁醇部位（36 g）。本研究先后对乙酸乙酯部位和正丁醇部位采用硅胶柱色谱进行初步分离,经薄层色谱检识后,进一步用硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱,制备薄层色谱、高效液相制备色谱反复分离纯化得到单体化合物。运用1H-NMR、（13）C-NMR波谱学方法对分离得到的单体化合物进行结构确证。结果:冬凌草通过系统提取分离,从中得到7个单体化合物,其中包括1个二萜类化合物,5个酚酸,1个甾醇:冬凌草甲素,咖啡酸,阿魏酸,原儿茶醛,水杨酸,绿原酸,β-谷甾醇。结论:本文对冬凌草的化学成分进行了研究,所选用的提取方法及提取溶剂适当,采用了硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、制备薄层色谱、制备液相色谱等分离手段,共分离得到7个化合物,并且运用多种现代波谱手段及其相关知识进行了结构确证,其中包括1个二萜类化合物,5个酚酸,1个甾醇:冬凌草甲素,咖啡酸,阿魏酸,原儿茶醛,水杨酸,绿原酸,β-谷甾醇,其中绿原酸为首次从该植物中提取分离得到。第二部分液质联用技术鉴定冬凌草中的二萜类成分目的:总结贝壳杉烷型二萜类成分的电喷雾质谱裂解规律,建立灵敏、有效的可用于鉴定冬凌草中二萜类成分的液质联用（LC-MS）分析方法。方法:通过电喷雾离子源负离子一级质谱扫描、母离子扫描和子离子扫描,研究16个二萜类成分对照品的质谱裂解途径,并总结其规律,进而联合采用多离子监测-信息依赖-增强型子离子扫描（MIM-IDA-EPI）和中性粒子缺失-信息依赖-增强型子离子扫描（NL-IDA-EPI）两种模式分析鉴定冬凌草中二萜类化合物。采用C18柱进行色谱分离,流动相为0.1%甲酸水-甲醇,梯度洗脱。结果:总结出7个二萜类成分的质谱裂解规律和相同构型且含有相同取代基的同分异构体在RP-HPLC上的洗脱顺序规律。据此鉴定出冬凌草提取物中40个二萜类成分。结论:本法灵敏度高、专属性强,成功用于冬凌草中二萜类化合物的结构鉴定。实验证实,MIM-IDA-EPI和NL-IDA-EPI扫描模式联用技术在化合物结构分析方面具有超过其单一模式的优越性,对控制中药材质量具有重要意义。第三部分液质联用技术同时测定冬凌草中28种成分及冬凌草质量表征目的:建立一种快速、准确、可同时测定冬凌草中28种化学成分（19种二萜类成分、6种酚酸及3种黄酮）的HPLC-ESI-MS分析方法,并用于冬凌草药材分析及质量调查。方法:取冬凌草药材粉末约1.0g,精密称定,加入25mL甲醇,密塞,称定重量,超声处理60min,放冷,称重,用甲醇补充减失的重量,摇匀,0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,进样测定。由MRM-IDA-EPI模式对28种化合物结构进行确证,采用MRM正负离子扫描模式建立其含量测定方法,并采用所建立的方法对不同产地的21批冬凌草药材进行分析。质谱条件:ESI源;正负离子同时监测;源喷射电压（IS）:5500V（正离子监测模式）,-4500 V（负离子监测模式）;离子源温度:600℃。雾化气（Gas1）:40psi,加热气（Gas2）:50psi,帘气:25psi。色谱条件:色谱柱:Diamonsil C18 column（250mm×4.6mm,5μm）;柱温:25℃;流动相:0.1%甲酸-甲醇（含0.1%甲酸）,梯度洗脱;分析时间:15.1min;流速:0.7mL·min-1,进样量10μL。结果:28种化学成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系,精密度、准确度、检测限和定量限均符合要求。样品测定结果表明,冬凌草产地、生长环境和采集时间均对28种活性成分的含量有影响,其中产地时间和生长环境是其中较为重要的影响因素。结论:本法简便、快速、专属性好,可用于冬凌草中28种化学成分的含量测定,除冬凌草甲素和冬凌草乙素外,其他17种二萜均为首次测定。该法对于冬凌草药材的质量控制具有重要意义。第四部分液质联用技术同时测定大鼠血浆中拉西多宁、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A及其药代动力学研究目的:建立一种基于多组分同时测定大鼠血浆中拉西多宁、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃给予冬凌草提取物后该4种成分的药代动力学研究,建立其药-时曲线,阐明药动学参数与特征。方法:大鼠灌胃给与冬凌草提取物(10mL·kg-1)后,分别于给药后10, 30,60,90,105,120,150,180,210,240,300和540min眼内眦静脉丛取血,制备血浆样品,采用液-液提取方法进行样品预处理,磺胺甲恶唑为内标。色谱柱为C18柱,流动相为0.1%甲酸水-甲醇,梯度洗脱,运行时间为13.50min。采用电喷雾离子源（ESI）,多周期正负离子同时扫描,多反应监测（MRM）模式进行定量。4种被测成分的监测离子对分别为拉西多宁和冬凌草甲素m/z 365.3/347.3,冬凌草乙素m/z 361.2/343.2,牛尾草素A m/z 363.2/283.1和磺胺甲恶唑m/z 254.1/156.0。结果:血浆中拉西多宁、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A分别在2.24～2240、4.92～4920、5.32～5320和1.36～1360ng·mL-1范围内线性关系良好（r≥0.998）,最低定量限（LLOQ）≤1.36ng·mL-1。日内、日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于9.1%,相对误差（RE）为-8.1%～4.1%。平均提取回收率为70.2%～108.0%。大鼠单次灌胃冬凌草提取物后,血浆中4种成分的药代动力学参数t1/2α,t1/2β和MRT具有一致性,且4种成分的吸收和消除均较快,但拉西多宁、冬凌草甲素和牛尾草素A的达峰时间比冬凌草乙素达峰时间长。结论:该法灵敏度高、选择性好、精密度好,可用于大鼠灌胃给与冬凌草提取物后,血浆中拉西多宁、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A的药代动力学研究,该结果可为冬凌草临床用药提供参考。第五部分液质联用技术测定大鼠胆汁中10种二萜类成分及其在胆汁中的排泄研究目的:建立一种可同时测定大鼠胆汁中10种主要二萜（开展香茶菜甲素,拉西多宁,冬凌草甲素,表诺多星,诺多星,冬凌草乙素,牛尾草素A,延命草醇,毛栲利素和贝壳松醇）含量的HPLC-MS方法,并用于大鼠灌胃给予冬凌草提取物后该10种成分的胆汁排泄研究。方法:健康SD雄性大鼠8只,随机分为空白对照组（2只）和试验组（6只）。试验组大鼠灌胃给予冬凌草提取物(10mL·kg-1),空白对照组给予等量的水后,行胆管切开术。分别收集0-1h,1-3h,3-5h,5-8h,8-12 h,12-20h和20-24h时间段的胆汁样品。采用液-液提取方法进行样品前处理,磺胺甲恶唑为内标。色谱柱为C18柱,流动相为0.1%甲酸水-甲醇,梯度洗脱,运行时间为15.10min。采用电喷雾离子源（ESI）,正负离子扫描,多反应监测（MRM）模式进行定量。测定大鼠灌胃给予冬凌草提取物后胆汁中10种二萜的累积排泄率。结果:所测的10种二萜中开展香茶菜甲素,拉西多宁,冬凌草甲素,表诺多星和冬凌草乙素的累积排泄率分别占给药剂量的10.67,11.23,9.77,20.81和8.55%,而化合物诺多星,牛尾草素A,延命草醇,毛栲利素和贝壳松醇的累积排泄率分别占给药剂量的20.61,17.22,15.63,8.87和19.42%。结论:经方法学考察符合生物样品的测定要求,可用于大鼠胆汁中10种二萜浓度的测定及排泄研究,待测10种二萜在01h内,排泄率最高,随着时间的推移,排泄率逐渐减少,但在35h时间段时略有增加,这可能是由于上述成分在肠道不同部位有所吸收入血所致,随后再逐渐下降所致。第六部分冬凌草甲素不同血浆中蛋白结合率测定目的:建立冬凌草甲素在大鼠血浆、人血浆和牛血清白蛋白中蛋白结合率的测定方法,并计算不同种属血浆蛋白的相关参数。方法:采用平衡透析法测定蛋白结合率,用高效液相色谱法测定血浆中药物总浓度及游离的药物浓度。结果:冬凌草甲素的血浆蛋白结合率分别为:大鼠血浆:69.66±12.8%、59.62±12.6%、57.94±4.1%;人血浆:78.15±3.6%、77.92±8.8%、76.72±7.3%;牛血清白蛋白:35.58±7.2%、34.59±10.8%、32.03±6.0%。结论:本文应用平衡透析法研究了冬凌草甲素与人血浆蛋白,牛血清白蛋白和大鼠血浆蛋白的结合情况,结果表明冬凌草甲素的血浆蛋白结合率在60%70%之间,属中度血浆蛋白结合率药物,大部分药物分子以游离形式发挥药效,并且不具有质量浓度依赖性,不易引起具有药理作用的游离型血药质量浓度发生明显变化,说明冬凌草甲素临床用药有较好的安全性。第七部分冬凌草甲素大鼠在体肠吸收动力学研究目的:建立同时测定肠循环液中冬凌草甲素与酚红浓度的HPLC/DAD法,探讨冬凌草甲素在大鼠各肠段的吸收动力学特征及不同药物浓度对其的影响。方法:采用大鼠在体肠吸收实验方法,以HPLC/DAD法测定肠循环液中药物的含量,色谱条件为:Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）;柱温30℃;流动相为甲醇-乙腈-0.5%的磷酸（55:15:30）,流速1.0 mL·min-1;检测波长238nm;进样量20μL。结果:在5.0～15μg·mL-1内冬凌草甲素的吸收量与质量浓度成线性关系,Ka值基本保持不变;冬凌草甲素各肠段的吸收速率无显著性差异,冬凌草甲素在十二指肠、空肠、回肠、结肠的Ka值分别为（0.0475±0.0062）,（0.0468±0.0051）,（0.0346±0.0037）,（0.0435±0.0023）h-1。结论:本文首次建立了HPLC/DAD法同时测定肠循环液中冬凌草甲素及酚红的浓度,该法操作简便,结果准确,灵敏度高。研究结果表明,冬凌草甲素在肠道的吸收呈现一级动力学过程,且吸收机制为被动扩散;冬凌草甲素在整个肠道均有吸收,提示可以将冬凌草甲素研制成缓释制剂。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 冬凌草化学成分的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 液质联用技术鉴定冬凌草中的二萜类成分
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 液质联用技术同时测定冬凌草中28 种成分及冬凌草质量表征
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第四部分 液质联用技术同时测定大鼠血浆中拉西多宁、冬凌草甲素、冬凌草乙素和牛尾草素A 及其药代动力学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第五部分 液质联用技术测定大鼠胆汁中10 种二萜类成分及其在胆汁中的排泄研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第六部分 冬凌草甲素不同血浆中蛋白结合率测定
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第七部分 冬凌草甲素大鼠在体肠吸收动力学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述 冬凌草二萜类成分的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历