虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）闭壳肌积累类胡萝卜素相关基因的筛查

论文摘要

虾夷扇贝是我国重要的海水经济养殖贝类之一,其相关的遗传育种工作正逐步展开。2003年本实验室在虾夷扇贝野生群体中发现了少数闭壳肌呈现鲜艳橘红色的突变个体,而普通虾夷扇贝野生个体的闭壳肌则呈现白色,两者对比明显。经统计,虾夷扇贝闭壳肌呈现橘红色是一种比例极小的突变现象,突变比例约占0.2%,该性状可以稳定遗传。实验室已经将选育得到的品种命名为“海大金贝”。海大金贝在抗逆性以及部分生长性状上明显优于对照组,具有较大的经济价值与研究意义。本课题组前期研究发现,这种现象是由于类胡萝卜素在虾夷扇贝闭壳肌中累积造成的,但调控类胡萝卜素累积的机制还不清楚。本研究利用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)对虾夷扇贝闭壳肌颜色差异相关基因进行筛选和分析。以虾夷扇贝红色闭壳肌cDNA为tester,白色闭壳肌cDNA为driver,构建正向差减文库;以虾夷扇贝白色闭壳肌cDNA为tester,红色闭壳肌cDNA为driver,构建反向差减文库。利用454测序技术对筛选得到的特异性cDNA进行测序分析,正向差减文库测序得到2640条序列,拼接得到50个contigs;反向差减文库测序得到2496条序列,拼接得到187个contigs。经过同源性分析,红柱特异性序列中获得了铁蛋白、紧密连接蛋白、锚蛋白、锰超氧化物歧化酶、磷酸葡萄糖变位酶等与类胡萝卜素累积上调相关的共27种基因,涉及渗透调节、细胞连接、肌肉运动、活性氧清除等方面;白柱特异性序列中获得了多聚泛素、PDZ结构域蛋白、溶质载体等与类胡萝卜素累积下调相关的共121种基因,涉及蛋白降解,信号传递,转录调控等方面。本研究结合红白柱虾夷扇贝转录组454测序结果,筛选得到了一大批在红白柱虾夷扇贝之间差异表达的基因。根据测序数据中基因的丰度水平对这些基因的差异显著性进行分析,并且通过查阅文献,了解相关基因的功能,最终通过候选基因法,我们在众多的差异表达基因中选择了三种清道夫受体SRB1、SRF2以及SRCR作为候选基因进行研究,原因有以下两个方面:首先,通过差异显著性检验,这三种清道夫受体的序列丰度在红白柱虾夷扇贝之间存在显著差异,推测其有可能与类胡萝卜素的累积和转运有关。第二,在果蝇的研究中,研究人员发现清道夫受体在介导组织细胞吸收类胡萝卜素的过程中起着关键性的作用,相对于其他候选基因,如铁蛋白,多聚泛素等,清道夫受体的调节作用更为直接明显。选取清道夫受体作为候选基因进行研究,并对其在红白柱虾夷扇贝各组织中的表达量水平进行检测,初步阐述了其在虾夷扇贝中的组织表达规律。根据结果推测在虾夷扇贝橘红色闭壳肌类胡萝卜素累积和转运的过程中,清道夫受体有可能是调节类胡萝卜素吸收的关键基因。本研究为虾夷扇贝闭壳肌类胡萝卜素累积相关通路的探索提供了重要的理论依据,有助于类胡萝卜素累积相关机制的进一步研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 橘红色闭壳肌虾夷扇贝的发现及选育
• 1.1 橘红色闭壳肌虾夷扇贝的选择与繁育
• 1.2 虾夷扇贝橘红色闭壳肌中主要色素的分离提纯与结构鉴定
• 1.3 虾夷扇贝类胡萝卜素的种类组成和累积变化规律
• 1.4 累积类胡萝卜素对虾夷扇贝闭壳肌的化学成分的影响
• 2 类胡萝卜素的生物代谢途径
• 2.1 类胡萝卜素的种类、分布与功能
• 2.2 类胡萝卜素在生物体内的合成与代谢
• 2.3 类胡萝卜素在动物体内的转运
• 3 筛选差异性表达基因的方法
• 4 抑制性差减杂交技术的原理
• 5 清道夫受体相关研究
• 5.1 清道夫受体家族
• 5.2 清道夫受体的功能
• 5.3 清道夫受体在类胡萝卜素转运中的作用
• 6 本研究的目的与意义
• 第二章 利用抑制性差减杂交技术筛选差异表达基因
• 1 实验材料
• 1.1 实验用扇贝及样品处理
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 虾夷扇贝闭壳肌组织RNA 的提取
• 2.2 虾夷扇贝闭壳肌mRNA 的纯化
• 2.3 突变体与对照组虾夷扇贝闭壳肌组织的抑制性差减杂交
• 2.3.1 cDNA 第一链的合成
• 2.3.2 cDNA 第二链的合成
• 2.3.3 RsaⅠ酶切
• 2.3.4 接头连接
• 2.3.5 连接效率检测
• 2.3.6 第一次杂交
• 2.3.7 第二次杂交
• 2.3.8 PCR 扩增
• 2.3.9 差减效率检测
• 2.4 差异片段的测序与分析
• 3 实验结果
• 3.1 虾夷扇贝闭壳肌组织RNA 的质量检测
• 3.2 虾夷扇贝闭壳肌组织mRNA 的质量检测
• 3.3 接头连接效率的检测
• 3.4 抑制性差减杂交产物的检测
• 3.5 cDNA 差减文库的构建及差减效率检测
• 3.6 差减杂交产物的测序及分析
• 4 讨论
• 4.1 抑制性差减杂交技术的评价与展望
• 4.2 筛选所得部分基因的功能
• 第三章 清道夫受体组织表达规律的研究
• 1 实验材料
• 1.1 实验用扇贝及样品处理
• 1.2 主要化学试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 实验方法
• 2.1 虾夷扇贝各组织RNA 的提取
• 2.2 虾夷扇贝各组织cDNA 的合成
• 2.3 荧光实时定量PCR 检测目的基因的表达
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文