论文摘要
背景川崎病（Kawasaki disease，KD）是一种常见的儿童自身免疫性血管炎综合征，并发冠状动脉瘤（CAA）和冠脉狭窄是青壮年猝死和心肌梗塞发生的重要原因，新近研究表明，儿童川崎病是成人缺血性心脏病发生的新的危险因素。川崎病已取代风湿热成为儿童后天性心脏病的主要病因。虽然静脉输注丙种球蛋白（IVlG）和阿斯匹林联合治疗方案广泛应用后，川崎病死亡率和冠状动脉并发症明显下降，但近年发现IVIG治疗耐药病例增多。迄今病因及发病机制未明，目前认为川崎病符合感染性疾病和自身免疫性疾病两大特征，细菌超抗原致病是引起川崎病的重要原因，川崎病异常的免疫激活，是由细菌或病毒毒素以超抗原机制介导引起的。但临床川崎病研究取材困难，国内外目前尚缺少公认的川崎病动物模型用于血管炎性损伤和冠状动脉瘤形成的发生机制研究。本研究采用干酪乳杆菌细胞壁成分（Lactobacillus casei cell wall extract，LCWE）注入幼年小鼠腹腔，观察能否引致小鼠冠状动脉炎，旨在探讨建立新的川崎病动物模型的可能性；探讨LCWE的超抗原活性及其与小鼠血管免疫性损伤和冠状动脉炎发生的关系及作用机制。并对临床病例进行研究以客观评价IVIG治疗和预防川崎病冠状动脉病变的疗效，探讨IVIG疗效的影响因素。第一部分一、LCWE诱导小鼠川崎病冠状动脉炎动物模型的建立目的：探讨干酪乳杆菌细胞壁成分诱导产生川崎病冠状动脉炎动物模型的可能性。方法：制备LCWE（1mg／ml）。将100只BALB／C小鼠随机分为实验组和对照组各50只。分别腹腔注射0.5ml LCWE和PBS。注射后1d、3d、5d、10d、和28d每组取10只小鼠分批采血、处死、留取心脏病理标本。在光学显微镜和电子显微镜下观察各器官组织病理变化；应用FACSort流式细胞仪检测小鼠CD4+、CD8+T细胞亚群的百分比，计算外周血CD4+、CD8+T细胞亚群的绝对数量；采用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测LCWE注射后3d小鼠血浆进行TNF-α、IL-1β和IL-6水平；并测量体重、心脏、脾脏重量、脾脏／体重及心脏／体重比值。结果：①冠状动脉炎损害的发生率：在实验组小鼠为92.5％。②病理学改变：心脏标本HE染色光镜检查显示冠状动脉炎损害早期（1～3d）以中性粒细胞为主伴有少量淋巴细胞和单核细胞浸润，血管中膜平滑肌细胞消失，晚期（28d）以巨噬细胞为主伴有少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润，冠脉管壁纤维细胞增生纤维化以及心内膜、心外膜、心肌炎，升主动脉及小血管周围炎。电镜检查显示实验组急性期冠状动脉血管内皮细胞大量广泛空泡变性，坏死、脱落，基底膜疏松，严重线粒体肿胀，内质网扩大，中膜增厚，中层细胞消失，纤维蛋白样沉积等改变。对照组各阶段心脏和血管均无炎症。③免疫学指标：外周血T细胞亚群检测显示实验组小鼠CD4+与CD8+T细胞亚群的绝对数量明显增高（P＜0.05），均在3d达到高峰：（8.23±1.32）×109／L及（6.19±1.08）×109／L。模型小鼠注射LCWE后3d血浆TNF-α、IL-1β及IL-6水平较对照组比较明显增高，有显著性差异。④实验组小鼠在5d、10d时体重、心脏、脾脏重量及脾脏／体重、心脏／体重比值均较对照组降低，差异有极显著性（P＜0.05）。结论：LCWE单次腹腔注射能够诱导BALB／C小鼠产生冠状动脉炎及心肌炎病理改变，是一种能够可靠反映川崎病冠状动脉炎的良好动物模型。其群体发病率高，病理损害与LCWE诱导的免疫反应有关。二、LCWE的超抗原活性及诱导小鼠冠状动脉炎发生的超抗原机制目的：研究超抗原LCWE激活小鼠T淋巴细胞TCR Vβ的特异性，LCWE刺激表达TCR Vβ2、4、6+T细胞增殖的特征；研究LCWE激活小鼠T细胞CD69体内外表达的动力学及其作用；探讨LCWE的超抗原活性与小鼠血管免疫性损伤和冠状动脉炎发生的关系及作用机制。方法：①4～6周龄幼年BALB／C小鼠122只，随机分为实验组与对照组。按前述方法应用LCWE建立小鼠冠状动脉炎动物模型。②小鼠分别腹腔注射超抗原LCWE、多克隆刺激剂Con A和PBS，应用流式细胞仪观察超抗原刺激TCR Vβ2、4、6+T细胞增殖的动力学变化。检测CD4+CD69+T细胞表达的百分率及动力学变化。③LCWE或Con A体外刺激BALB／C小鼠脾单个核细胞，观察离体条件下LCWE与小鼠TCR Vβ结合的特异性；观察LCWE5、10、15、20、25、40μg／ml或SEB 2.5μg／ml或Con A溶液（1mg／ml，20μl）终浓度10μg／ml或PBS刺激下；CD4+T细胞CD69表达的阳性率及动力学变化。④采用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测血浆IL-1β、IL-6和TNF-α水平。⑤应用相关模型观察TCR Vβ6+CD4+T细胞增殖与T细胞活化CD69抗原表达和与血浆TNF-α水平变化的相关关系，TCR Vβ6+CD4+T细胞增殖与血浆TNF-α水平变化的相关关系。⑥应用Logistic回归模型，分析冠状动脉炎发生与TCR Vβ+T细胞增殖、与T淋巴细胞活化及与TNF-α产生的关系。结果：①LCWE腹腔注射，刺激表达TCR Vβ2、4、6的T细胞增殖，与注射前比较，P＜0.001；与腹腔注射Con A组比较，P＜0.05。②表达TCR Vβ家族的T细胞增殖之后，迅速出现增殖消退。实验结果显示CD4+TCR Vβ6+T细胞在注射LCWE 3d达高峰（11.11±1.08）％，5d下降回到基线（1.93％），10d降至0.98％。表达TCR Vβ2的CD4+T细胞百分比的走势及表达TCR Vβ4的CD4+T细胞百分比的走势与CD4+TCR Vβ6T细胞基本一致。③超抗原活性与小鼠冠状动脉炎密切相关。LCWE注射后冠状动脉炎的发生与TCR Vβ+T细胞增殖、T淋巴细胞活化及TNF-α产生有关，Wald卡方值分别为12.473，P＜0.001、11.912，P＜0.05和3.469，P＜0.05。发生冠状动脉炎组与未发生冠状动脉炎组比较，TCR Vβ+T细胞明显增多，t=3.469，P＜0.001；淋巴细胞显著活化，t=4.143，P＜0.001；TNF-α的水平增高，t=5.978，P＜0.001。实验组有冠状动脉炎发生者血浆TNF-α为2513.7±547.6，实验组无冠状动脉炎发生者血浆TNF-α为1179.3±295.9，两组比较有显著性差异，t=7.201，P＜0.001。④TCR Vβ6+T细胞增殖和T细胞活化（CD69的增加）及TNF-α的产生密切相关，相关系数分别为r=0.884，P＜0.05：r=0.846，P＜0.001。CD69+T细胞增殖与TNF-α产生密切相关，r=0.947，P＜0.05。⑤LEWC刺激体内CD69+T细胞表达的动力学变化显示，BALB／C小鼠注射LCWE后，脾及外周血单个核细胞表达CD4+CD69+T细胞的百分率增高，与对照组比较有显著差异，P＜0.001。小鼠的脾单个核细胞，在LCWE注射后3h开始升高（19.32％），12h达高峰（38.8％），以后明显下降，24h为9.89％；其外周血单个核细胞表达CD4+CD69+T细胞百分率的走势与此一致。但脾单个核细胞表达CD4+CD69+T细胞的百分率高于外周血单个核细胞，P＜0.001。体内T细胞CD69一过性高表达之后下降速度快、幅度大。LCWE刺激体外CD4+T细胞CD69表达增加，其峰值高，与LCWE体内刺激比较，P＞0.05。结论：①LCWE诱导小鼠产生严重的免疫性损伤和冠状动脉炎的作用是通过超抗原机制实现的：②LCWE可直接诱导早期T细胞活化，具体表现为CD4+CD69+T细胞显著增高；③LCWE诱导机体产生炎性细胞因子TNF-α显著增多，该炎性因子可能是引起冠状动脉炎产生的重要机制。阻断TNF-α的活性有可能成为川崎病治疗的药物靶点。三、白三烯B4受体在免疫性血管炎发病机制中的作用目的：研究冠状动脉炎模型小鼠心脏和肝脏中BLT1 mRNA和BLT2 mRNA的表达；模型小鼠脾脏中CD4+T细胞BLT2的表达，探讨LTB—BLT1、LTB—BLT2通路在小鼠冠状动脉炎发生中的作用。方法：采用逆转录—聚合酶链反应（RT—PCR）的方法，提取细胞总RNA，以Olig（dT）引导合成cDNA第一链，经PCR扩增，以BLT1或BLT2为引物，从心脏和肝脏组织中扩增出BLT1 mRNA或BLT2 mRNA。采用凝胶图像分析仪分析BLT1与β-actin mRNA及BLT2与β-actin mRNA的表达水平；应用流式细胞术间接荧光标记检测脾单个核细胞中CD4+T细胞上BLT2的表达。采用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法，检测血浆IL-1β、IL-6和TNF-α水平。结果：扩增出分子量为430 bp的BLT1 mRNA和分子量为331 bp BLT2 mRNA。模型小鼠在注射LCWE后6h开始升高，12h达高峰，持续至3d逐渐降低，5d时回到基线；心脏和肝脏表达BLT1 mRNA和BLT2 mRNA，分别进行组内各时间点比较，注射LCWE后12小时，BLT1 mRNA和BLT2 mRNA的光密度比值显著升高，P＜0.05。流式细胞术检测显示，在注射LCWE后1d小鼠脾脏BLT2+CD4+T细胞表达高峰，高峰时间较BLT2 mRNA在心脏和肝脏的表达延迟。模型小鼠注射LCWE后3d血浆TNF-α、IL-1及IL-6水平较对照组比较明显增高，P＜0.001。结论：在LCWE诱导的小鼠免疫性损伤和冠状动脉炎的产生过程中，BLT1、BLT2在肝脏和心脏高表达：在脾单个核细胞BLT2在CD4+T细胞表达增加。LCWE能诱导小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6等多种炎性介质分泌增加。因此，LTB-BLT1、LTB—BLT2通路可能在小鼠冠状动脉炎发生中起重要作用。第二部分静脉输注丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉病变的疗效评价目的：客观评价静脉输注丙种球蛋白（IVIG）治疗和预防川崎病（KD）冠状动脉病变（CAL）的疗效，探讨IVIG疗效的影响因素。方法：对314例KD患儿进行回顾性对比观察。按照治疗分为阿斯匹林（ASA）+IVIG组和ASA组，观察两组CAL发生、恢复情况、不同时机不同剂量IVIG治疗KD疗效，及平均住院时间、退热时间、总热程、血小板计数、血沉、C反应蛋白等临床及实验室指标，急性期出现CAL者分别于病程1m，3m，6m，12m复查。结果：ASA+IVIG组CAL发生率34.3％，ASA组56.0％，两组比较P＜0.001。应用IVIG 2.0 g／kg或1.0 g／kg以及在病程3～10天应用IVIG，CAL发生率低，P＜0.05。22.2％CAL发生在IVIG治疗后：13.4％CAL在病程12月仍不能恢复正常，多数为IVIG治疗开始时间超过10天者。ASA+IVIG组住院时间、退热时间、总热程缩短，血小板计数、血沉、C反应蛋白显著降低（P＜0.05）。IVIG耐药病例占10.5％。结论：IVIG治疗可显著缩短KD病程和降低CAL事件发生，但对川崎病CAL防治并非人们所预期的那样有效，其实际疗效需要再评价。
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