论文摘要
罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）又名马来西亚大虾，我国淡水甲壳类的主要养殖品种。我国罗氏沼虾的养殖面积达50万亩以上，总产量超过10万吨，已成为全球罗氏沼虾养殖大国。罗氏沼虾肌肉白浊病是近年来发生在我国罗氏沼虾主要产区的一种新型疾病，又称为罗氏沼虾白体病或罗氏沼虾白尾病，主要危害罗氏沼虾淡化苗，病虾表现为肌肉出现白斑、白浊或全身发白，病虾可在几天内死亡，死亡率最高达40％～90％。该病于1994年后在我国广东省发现，2000年浙江、江苏、上海、广东、广西等地出现较大规模的流行，给许多养殖场及育苗场造成了巨大的损失。作者对浙江省某罗氏沼虾苗种场发生典型肌肉白浊病的虾苗进行了病原研究，通过细菌分离、除菌组织悬液制备及人工感染试验、超薄切片、病毒粗提取，结果表明：从白浊病病虾的肌肉、肝胰腺中分离到的细菌以5×108CFU／ml浓度浸泡感染正常沼虾苗不能复制疾病；病虾除菌组织过滤液以1:50、1:250浓度浸泡感染正常虾苗，7天后可发病，并出现典型的肌肉白浊病症状，氯仿处理不能破坏病毒的感染力；通过病虾超薄切片电镜观察发现肌肉间隙组织中存在23-25nm大小的球状病毒。病虾组织浆经氯仿处理、PEG沉淀、磷钨酸负染后可见到大量22nm大小的球状病毒颗粒，无囊膜。采用Trizol试剂进行了病毒的核酸提取，电泳结果发现2个核酸片段，分别为3.0Kb、1.3Kb，病毒核酸对RNA核酸酶、S1核酸酶敏感，对DNA酶抵抗，为单链RNA病毒，符合诺达病毒的特性。用罗氏沼虾诺达病毒核酸探针进行分子杂交，探针可与提纯核酸及病虾样品匀浆液反应，Sounthern杂交表明3.0Kb、1.3Kb条带分别属于诺达病毒的RNA1和RNA2，表明我国发现的诺达病毒与法属瓜德罗普岛的诺达病毒存在较大同源性。该病毒命名为罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii nodavirus，MrNV）。用PEG沉淀结合超速离心，提纯了MrNV。用纯化MrNV免疫BALB／c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2／0鼠骨髓瘤细胞融合，研制了抗MrNV的鼠单克隆抗体。用纯化MrNV包板间接ELISA筛选阳性融合孔，经有限稀释法克隆，共得到12株能特异分泌抗MrNV的单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞。注射小鼠，制备腹水单克隆抗体，ELISA效价为1:105～106。亚型鉴定结果表明，有6株单抗为IgG1型，4株单抗为IgG2a型，2株单抗为IgG2b型。12株单抗与WSSV和TSV均无交叉反应。对所获得的单克隆抗体进行了Wesrern bolt分析，表明所获单抗可与罗氏沼虾诺达病毒43kD的主要外膜蛋白特异性结合。采用提纯病毒制备了罗氏沼虾诺达病毒兔抗血清，通过兔抗血清及罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体285，建立了三抗体夹心酶联免疫检测方法（TAS—ELISA），研究了TAS—ELISA最适反应条件为：兔抗体以1μg／ml包板，小鼠单抗285工作浓度1:50，000。该法检测MrNV的灵敏度达0.98ng，对WSSV、TSV及其它细菌感染死亡的罗氏沼虾苗没有非特异性反应。通过对2000—2002年病虾及疑似病虾的病毒检测，表明TAS—ELISA法比间接ELISA法和核酸电泳法有更高的阳性检出率和符合率；降低测定孵育温度和缩短孵育时间对病毒检测无明显影响，使得本法更加适合于生产实践。采用罗氏沼虾肌肉白浊病典型病虾菌制备病毒悬液，对罗氏沼虾苗种进行了人工感染试验。结果表明：罗氏沼虾诺达病毒对健康罗氏沼虾苗种有极强的致病力，发病高峰出现在病毒感染后9-12天；病毒悬液以1:62500稀释仍可使虾苗发病，最低感染剂量相当于0.6ng；不同的养殖环境对于病毒感染的发病过程与死亡率有极强的相关性，在光照条件下，发病死亡率可大大降低；缅甸原种与本地种群均表现出的罗氏沼虾诺达病毒的敏感性，但缅甸原种死亡率略低于本地种群，且发病过程也相对较长，表现为一定的病毒抵抗力。通过免疫酶技术分析了病毒的组织嗜性，发现诺达病毒有较强的肌肉组织嗜性，主要分布在肌肉组织中，肝胰腺等组织中未发现病毒感染，这与罗氏沼虾肌肉白浊病的发病症状相一致。
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