陆地棉花芽分化诱导阶段茎尖的表达谱分析

论文摘要

棉花是重要的经济作物和战略物资,而“人多地少”是我国的基本国情,长期以来粮棉争地矛盾突出,早熟育种正是顺应这一发展趋势的产物。花发育与棉花早熟性密切相关,而花芽分化诱导阶段是成花过程的关键步骤。本研究以早熟品种中棉所36和晚熟品种TM-1为材料,运用新兴的数字基因表达谱技术,获得了中棉所36子叶展平期到三片真叶展平期四个叶龄和TM-1一片真叶展平期到三片真叶展平期三个叶龄棉苗茎尖的数字基因表达谱数据。通过分别对中棉所36和TM-1各个时期基因表达谱数据的差异表达比较分析,并且两个材料花芽分化起始阶段相对应的差异表达基因相比较,筛选出一批与花芽分化起始过程有明显相关的重要基因以及生物学通路,并得到早熟品种中棉所36在这一过程中与晚熟品种TM-1表达模式不同的基因。这些数据的获得,为以后分离鉴定在早熟品种花芽分化起始阶段起关键作用的基因提供了大量的候选基因,为探明陆地棉花芽分化诱导机理以及早熟品种花芽分化起始较早的分子机理奠定了坚实的基础。取得的主要实验结果和结论如下：1.通过对早熟品种中棉所36和晚熟品种TM-1主茎生长点制作石蜡切片,然后镜检发现中棉所36是在二片真叶展平时顶芽开始分化出花芽原基,TM-1是在三片真叶展平时开始花芽的形态分化。说明早熟品种花芽分化起始时期早于晚熟品种。2.运用新兴的Illumina/Solexa高通量测序技术,对中棉所36子叶展平期到三片真叶展平期四个叶龄和TM-1一片真叶展平期到三片真叶展平期三个叶龄的棉苗茎尖RNA样品分别进行Tag-sequencing测序,获得这七个时期大量的mRNA标签,然后与参考基因序列数据库DFCI Cotton Gene Index database进行比对,完成基因表达注释。3.通过分别对中棉所36和TM-1这两个材料的不同时期数字基因表达谱数据,依次进行两两比较,筛选差异表达基因,结果发现中棉所36中子叶展平vs一片真叶展平组合的差异表达基因数目最多,TM-1中二片真叶展平vs三片真叶展平组合的差异表达基因数目最多。进一步分析发现,花分生组织特性基因AP1同源基因和棉花花芽分化诱导途径整合基因GhSOCl都是在中棉所36子叶展平vs一片真叶展平显著上调表达,在TM-1二片真叶展平vs三片真叶展平上调表达到高峰。因此,推测中棉所36在子叶展平和一片真叶展平之间花芽分化诱导相关的基因差异表达,而TM-1在二片真叶展平和三片真叶展平之间花芽分化诱导相关基因差异表达。4.通过比较中棉所36子叶展平vs一片真叶展平与TM-1二片真叶展平vs三片真叶展平两个组合中的差异表达的基因,从表达趋势相同的基因中发现赤霉素合成和信号转导相关基因,深入分析推断霉素途径参与陆地棉花芽分化诱导过程,而且起促进作用。表达趋势相同的上调基因继续与TM-1一片真叶展平vs三片真叶展平的上调基因进行比较,共同上调的基因与陆地棉花芽分化诱导过程相关。表达趋势相同的下调基因中发现VIP3的同源基因,说明这部分基因中包括负调控陆地棉花芽分化起始的基因。表达趋势不同的基因中与花芽分化相关基因,比如SPL3、VRN1、FVE等的同源基因,可以作为进一步克隆与早熟品种花芽分化较早相关基因的候选基因。5.从各个时期显著差异表达的基因中随机挑选出6个基因,通过荧光定量PCR技术检验数字表达谱数据的准确性。结果发现虽然个别基因荧光定量PCR结果和数字表达谱分析结果有些差异,但大多数基因整体趋势两者基本一致,表明数字表达谱分析结果比较准确。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 1 前言
• 1.1 植物花芽分化诱导阶段的调控及相关基因研究进展
• 1.1.1 光周期反应途径
• 1.1.2 春化反应途径
• 1.1.3 自主反应途径
• 1.1.4 赤霉素反应途径
• 1.1.5 其它因素的影响
• 1.1.6 各条途径间的相互作用
• 1.2 转录组学分析方法的研究进展
• 1.2.1 基于核酸杂交的表达谱分析方法
• 1.2.2 基于第一代测序技术的表达谱分析方法
• 1.2.3 基于新一代高通量测序技术的表达谱分析方法
• 1.3 本研究的目的意义
• 2 材料方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 中棉所36和TM-1花芽分化时期的观察
• 2.2.2 所取样品RNA的提取
• 2.2.3 RNA的检测
• 2.2.4 反转录
• 2.2.5 荧光定量PCR
• 2.2.6 Tag的制备及测序
• 2.2.7 测序数据的分析
• 3 结果与分析
• 3.1 解剖学观察
• 3.2 RNA质量检测
• 3.3 测序质量评估
• 3.3.1 Tag的整体质量评估
• 3.3.2 Clean Tag拷贝数分布统计
• 3.3.3 测序饱和度分析
• 3.4 基因表达注释
• 3.4.1 参考基因序列数据库的基本情况
• 3.4.2 Clean Tag比对具体情况的统计分析
• 3.4.3 酶切效率评价
• 3.5 差异表达基因的筛选
• 3.6 数据的深入分析
• 3.6.1 持家基因的表达分析
• 3.6.2 花芽分化标志基因的表达分析
• 3.6.3 花芽分化诱导相关基因差异表达时期的确定
• 3.6.4 中棉所36与TM-1差异表达基因的比较
• 3.6.5 Pathway显著性富集分析
• 3.7 荧光定量PCR结果验证数字基因表达谱分析的准确性
• 4 讨论
• 4.1 早熟品种与晚熟品种花芽分化解剖学观察的比较
• 4.2 参考基因序列数据库的选择
• 4.3 比对标准的确定
• 4.4 中棉所36花芽分化诱导相关基因的表达
• 4.5 陆地棉花芽分化诱导途径的分析
• 4.6 陆地棉数字基因表达谱数据分析中的问题
• 4.7 本研究的不足与展望
• 参考文献
• 附表
• 致谢