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1，8-桉叶素抗IBV作用效果及机制研究

2020-12-07阅读(202)

1，8-桉叶素抗IBV作用效果及机制研究

论文摘要

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是巢状病毒目（Nidovirales）中冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属的代表种,它所引起的鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）是一种急性的高度接触性疾病。由于血清型多、各血清型之间缺乏交叉保护及遗传性变异,使IB的防治难度增大,在世界范围内造成了巨大的经济损失,仍是当今危害家禽养殖业最严重的疫病之一。1.本文首次研究了1,8-桉叶素与IBV的相互作用,结果表明1,8-桉叶素有抑制IBV作用,主要是体外直接灭活作用,在IBV吸附和复制阶段也有一定作用。a.TD01,8-桉叶素抗IBV作用效果最好,此时病毒抑制率达到85.36%±2.31%,且其与IBV体外作用60min时,存在明显的直接灭活病毒活性,病毒抑制率可达到82.63%±1.14%。b.在预处理病毒、复制、预处理细胞及吸附四种作用模式中,1,8-桉叶素对IBV抑制率分别为82.63%±1.32%、61.68%±2.11%、12.13%±1.09%及5.32%±1.14%。2.本文首次初步探讨了1,8-桉叶素与IBV的相互作用机制,结果表明1,8-桉叶素与病毒N蛋白的受体结合部位有较强作用力,可抑制病毒复制及组装;1,8-桉叶素与IBV相互作用可引起预处理病毒、复制、吸附及预处理细胞模式的细胞在G1期阻滞;1,8-桉叶素对宿主细胞有保护作用;1,8-桉叶素可引起复制模式细胞出现凋亡现象,而其预处理IBV则可明显减少病毒引起的宿主细胞凋亡作用。a.应用分子模拟软件分析了1,8-桉叶素与IBV N蛋白之间的作用,发现1,8-桉叶素与N蛋白的受体结合部位有较强作用力,总作用力为-39.97kcal·mol-1,这表明1,8-桉叶素对于病毒复制及组装有抑制作用。b.通过流式细胞仪测定1,8-桉叶素与IBV作用对宿主细胞周期的影响,发现与细胞对照G1期（41.23%±1.21%）相比,预处理病毒、复制、预处理细胞及吸附四种模式的G1期均有不同程度的增加,其值分别为47.49%±1.43%、50.11%±2.11%、52.41%±1.15%及56.36%±0.98%;与细胞对照S期（30.98%±0.67%）相比,预处理病毒、复制、预处理细胞及吸附模式的S期均有所减少,其值分别为27.21%±1.11%、24.56%±1.23%、22.58%±0.78%及22.04%±0.91%;与细胞对照G2/M期（27.79%±0.97%）相比,预处理病毒、复制、预处理细胞及吸附模式的G2/M期均略有减少,其值分别为25.29%±1.16%、25.34%±0.99%、25.02%±1.31%及21.60%±0.64%。结果表明1,8-桉叶素对预处理病毒及复制模式的细胞周期影响很小,而对吸附及预处理细胞模式的周期影响相对较大,均引起细胞在G1期阻滞。c.1,8-桉叶素对于细胞膜中的磷脂及胆固醇均有较好去除效果,未加药物细胞膜中磷脂含量为31.23%±3.24%,加入TD0及2TD0的1,8-桉叶素后其磷脂含量降为14.14%±1.45%和3.11%±1.12%,对磷脂的去除率分别达到54.72%和90.04%。与TD01,8-桉叶素作用后细胞的胆固醇含量降为22.78%±2.11%,其去除胆固醇能力与5mMMβCD接近。以上结果证明1,8-桉叶素可以通过去除宿主细胞膜中胆固醇及磷脂的方式抑制IBV与宿主细胞结合,从而起到保护细胞的作用。d.通过DNA凋亡实验研究发现,预处理病毒对细胞的破坏作用最小,细胞几乎没有出现弥散。预处理细胞、吸附及复制模式都出现了不同程度的弥散,复制模式细胞死亡数明显少于吸附及预处理细胞模式,出现细胞凋亡现象。本文首次从细胞、分子水平研究了1,8-桉叶素抗IBV的作用效果及机制,为研制出天然、高效、无毒的抗IBV的消毒药物,提供了不可缺少的科学依据,为植物药的开发和利用,开发出高附加值的产品提供新的思路。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  • 1.1 课题背景
  • 1.2 植物精油概述
  • 1.2.1 植物精油的概念和理化性质
  • 1.2.2 植物精油的组成成分
  • 1.2.3 植物精油的提取
  • 1.2.4 植物精油的药理作用
  • 1.3 1,8-桉叶素的研究概况
  • 1.4 鸡传染性支气管炎病毒研究综述
  • 1.4.1 IBV形态结构
  • 1.4.2 IBV的培养特性
  • 1.4.3 IBV的理化学特性
  • 1.4.4 IBV的流行病学
  • 1.4.5 IBV的防治
  • 1.4.6 本研究课题的来源及主要研究内容
  • 2 1,8-桉叶素纯度分析
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 气相色谱条件
  • 2.1.3 质谱条件
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 1,8-桉叶素GC-MS分析
  • 2.3 讨论
  • 2.4 本章小结
  • 3 1,8-桉叶素抗IBV作用研究
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 仪器
  • 3.1.2 实验药品及材料
  • 3.1.3 细胞株及病毒株
  • 3.1.4 细胞的复苏及培养
  • 3.1.5 病毒株毒力的测定
  • 3.1.6 1,8-桉叶素对Vero细胞毒性测定
  • 3.1.7 1,8-桉叶素抗IBV作用实验
  • 3.2 结果
  • 3.2.1 IBV对Vero细胞的半数感染量及1,8-桉叶素对Vero细胞毒性测定结果
  • 3.2.2 1,8-桉叶素抗IBV作用结果
  • 3.2.3 利用倒置显微镜观察1,8-桉叶素与IBV作用
  • 3.3 讨论
  • 3.4 本章小结
  • 4 1,8-桉叶素抗IBV作用机制研究
  • 4.1 应用分子对接方法预测1,8-桉叶素与IBV N蛋白相互作用
  • 4.1.1 材料与方法
  • 4.1.2 1,8-桉叶素与IBV的N蛋白受体结合部位对接结果
  • 4.2 应用流式细胞仪研究1,8-桉叶素与IBV作用对细胞周期的影响
  • 4.2.1 实验主要仪器及材料
  • 4.2.2 实验方法
  • 4.2.3 结果
  • 4.3 通过细胞膜中磷脂及胆固醇含量变化研究1,8-桉叶素与IBV作用机理
  • 4.3.1 实验主要材料及仪器
  • 4.3.2 实验方法
  • 4.3.3 结果
  • 4.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA变化
  • 4.4.1 实验主要材料与仪器
  • 4.4.2 实验方法
  • 4.4.3 结果
  • 4.5 讨论
  • 4.6 本章小结
  • 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢

    • 相关论文文献

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