猪圆环病毒2型cap蛋白在昆虫细胞中的表达及间接ELISA抗体诊断方法的建立

论文摘要

猪圆环病毒感染是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的一种新传染病,母猪表现为繁殖障碍,仔猪和断奶猪主要特征为猪体质下降,消瘦,呼吸困难,咳喘,腹泻和黄疸等。该病毒与多种猪病相关,主要引起仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍、猪呼吸综合征、肉芽肿性肠炎、坏死性淋巴腺炎、渗出性皮炎,仔猪先天性展颇等。尤其PMWS,该病最早于1991年在加拿大西部发现,其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等,病原学及血清学调查表明,该病在许多国家都广泛存在,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。因此,建立有效快速的PCV2检测诊断方法非常有必要。目前PCV2的诊断方法主要有病毒的分离和鉴定、PCR法、免疫荧光法和ELISA法等。相比而言,ELISA法操作较为简单。研究通过基因的克隆和杆状病毒表达,以初步建立ELISA检测方法,用于PCV2抗体检测。PCV2含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白（rep）和核衣壳蛋白（cap）,其中Cap含有病毒主要抗原表位,因此选择ORF2全长基因及部分基因（去掉定位基团）为目的基因。根据GenBank数据库中的PCV2基因序列设计了2对引物,并含有SalⅠ和NotⅠ酶切位点。用PCR技术从国内分离的PCV2毒株获得大小为702bp（Cap）和579bp（ΔCap）的PCR产物,将其克隆至pMD18-T载体,提取质粒经SalⅠ和NolⅠ双酶切鉴定并测序,序列测定结果表明,扩增的Cap/ΔCap基因与PCV2株核苷酸序列符合率100%,氨基酸序列符合率100%。将质粒与转移载体pFastBacl分别进行双酶切,经回收后连接。连接产物转化DH5α,得到重组转移质粒pFastBacl-Cap和pFastBacl-ΔCap,提取阳性克隆质粒转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的受体菌E.coliDH10Bac,筛选出白色菌落得到重组穿梭载体Bacmid-Cap/Bacmid-ΔCap,提取质粒,经PCR鉴定为阳性后,转染Sf9昆虫细胞,5天后收获病毒。经RT-PCR、IFA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定Cap/ΔCap.基因的转录和表达,结果表明,重组杆状病毒Cap（约29KD）和ΔCap（约24KD）蛋白在Sf9昆虫细胞中得到表达。分别以重组杆状病毒Cap蛋白和ΔCap蛋白为抗原,建立检测测PCV2血清抗体水平的间接ELISA方法,判定P/N值≥2.1和P/N值≥2.2为阳性,并对两种ELISA方法的检测结果进行比较。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献综述 猪圆环病毒研究进展
• 1.病毒的发现
• 2.病毒的理化特性
• 3.病毒的增殖特性
• 4.病毒的分子生物学研究进展
• 5.PCV2的流行病学
• 6.PCV2所致猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）
• 7.PCV2的致病机理
• 8.PCV2诊断方法的研究
• 9.PCV2相关疾病的防制
• 10.潜在的公共卫生学意义
• 参考文献
• 第一章 猪圆环病毒2型重组cap蛋白的构建及其在昆虫细胞中的表达
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 第二章 PCV2抗体间接ELISA方法的建立
• 1.材料与方法
• 2.结果
• 3.讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录
• 致谢