论文摘要
研究背景进入21世纪后,我国肺结核防治局面依然十分严峻。结核病疫情呈现感染率高、患病率高、发病率高、耐药率高、死亡率高,结核病控制进程慢等“五高一慢”的特点。结核病疫情农村高于城市、青壮年患病率和死亡比例高,严重危害着人民群众的生命安全。结核分枝杆菌（Mycobacterium Tuberculosis, MTB） L型（L form, L）是结核分枝杆菌抵抗外界环境和赖以生存的重要形式,可在体内长期存活、生长、繁殖,导致结核病缓慢地进展、恶化、复发和耐药。近年来国内外的多项研究结果显示,菌阴肺结核约占活动性肺结核病的70%,而在菌阴肺结核标本中,MTB-L阳性率约为30%；在耐多药结核病（MDR-TB）患者中MTB-L阳性率达50%。因此,探索MTB-L检测方法对确定结核感染的性质和进展,选择治疗策略及其效果评价和判定预后、以及修正预防措施具有非常重要的意义。研究目的针对当前结核病防控的严峻形势,以及MTB-L生物学特性和致病性特点,本研究拟系统分析深圳市罗湖辖区结核病感染及耐药状况,建立快速简便、灵敏度高、特异度好的MTB-L的涂片染色和培养药敏的检测方法,并探讨其对结核病诊疗的临床价值。研究内容本研究拟开展以下工作：①建立快速简便、灵敏度高、特异度好的MTB-L的涂片染色和培养药敏的检测方法,并进行方法学评价。②采用改进的MTB-L涂片染色方法对深圳市罗湖区慢性病防治院2010年1月至2011年12月期间结核病门诊收治的960例结核病确诊患者及其治疗期间的痰标本同时进行MTB和MTB-L涂片染色检查。③采用改进的MTB-L药敏培养方法对上述痰标本进行MTB-L培养及药敏分析。④采用罗氏药敏培养基对上述痰标本进行MTB培养及药敏分析。⑤分析深圳市罗湖辖区结核病流行现状,MTB和MTB-L的耐药情况,以及其对结核病临床诊断和治疗预后的影响。研究方法1MTB-L涂片染色方法的改进及其方法学评价1.1Ziehl-Neelsen（Z-N）抗酸染色法①涂片：收集病例,按《结核病诊断细菌学检验规程》要求,挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml,于玻片正面右侧2/3处,均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜,痰膜朝上静置自然干燥,每位病人涂片2张。②染色：玻片经火焰固定后,滴加石碳酸复红染液盖满痰膜,在火焰高处徐徐加热,切勿沸腾,出现蒸汽即暂时离开,若染液蒸发减少,应再加染液,以免干涸,加热3～5min,待标本冷却后流水自玻片一端轻缓冲洗,洗去染色液,沥去玻片上剩余的水。自痰膜上端外缘滴加3%盐酸酒精,流过痰膜,需脱至痰膜无可视红色为止,脱色应单片进行。流水自玻片一端轻缓冲洗,冲去脱色液,沥去玻片上剩余的水。滴加亚甲蓝复染液,染色30s。流水自玻片一端轻缓冲洗,冲去复染液,沥去标本上剩余的水。③镜检：待玻片干燥后镜检,记录结果。1.2改良IK抗酸染色法①涂片：收集病例,按《结核病诊断细菌学检验规程》要求,挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml,于玻片正面右侧2/3处,均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜,痰膜朝上静置自然干燥,每位病人涂片2张。②染色：涂片于空气中自然干燥后,丙酮固定；玻片倾斜,蒸馏水自一端流下清洗。加苯酚品红液后置湿盒内,于室温24h后细流水洗。自痰膜上端外缘滴加0.5%盐酸乙醇脱色剂,脱至无红色为止。加复染剂亚甲蓝,复染0.5～2min,水洗后干燥。③镜检：待玻片干燥后镜检,镜检方法、结果判断和分级报告标准同Ziehl-Neelsen抗酸染色法。1.3本研究改进的MTB-L抗酸染色法（以下简称‘’MTB-L抗酸染色法”）①涂片：收集病例,按《结核病诊断细菌学检验规程》要求,挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05～0.1ml,于玻片正面右侧2/3处,均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜,痰膜朝上静置自然干燥,每位病人涂片2张。②染色：玻片经火焰固定后,滴加石碳酸复红染液盖满痰膜,然后加滴2～3滴双氧水,混匀,保持染色1～2min。流水自玻片一端轻缓冲洗,洗去染色液,沥去玻片上剩余的水。自痰膜上端外缘滴加3%盐酸酒精,流过痰膜,需脱至痰膜无可视红色为止,脱色应单片进行。流水自玻片一端轻缓冲洗,冲去脱色液,沥去玻片上剩余的水。滴加亚甲蓝复染液,染色30s。流水自玻片一端轻缓冲洗,冲去复染液,沥去标本上剩余的水。③镜检：待玻片干燥后镜检,镜检方法、结果判断和分级报告标准同Ziehl-Neelsen抗酸染色法。本改良方法染色合格的玻片呈亮蓝色,且放置于报纸上可透过痰膜分辨报纸上的文字。1.4荧光定量PCR法①DNA提取：收集样本,按试剂说明书要求处理样本,提取DNA；②PCR扩增：按试剂说明书要求进行荧光定量PCR扩增检测；③结果分析：分析扩增曲线,判定结果。1.5方法学评价取经我院肺科门诊确诊的活动性肺结核患者100例和健康体检者20例的痰标本,分别采用荧光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法,以及改良IK抗酸染色法进行检测,计算并评估荧光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的特异度、灵敏度、试验总有效率等指标；分别比较荧光定量PCR法MTB-L阳性检出率与后三种方法MTB-L阳性检出率的差异。2改进的MTB-L涂片染色法的临床应用采用MTB-L抗酸染色法对深圳市罗湖区慢性病防治院2010年1月至2011年12月期间结核病门诊收治的960例结核病确诊患者及其治疗期间的痰标本同时进行MTB和MTB-L涂片染色检查,分析深圳市罗湖辖区结核病流行现状,MTB和MTB-L的感染情况,以及其对结核病临床诊断和治疗预后（阴转率）的影响。3MTB-L培养基的改进及其方法学评价3.1罗氏培养基常规培养法收集肺结核确诊病人痰样本,采用碱处理法进行前处理,痰液中加4%NaOH约2～4倍量,振荡器振荡1min后,室温放置15-20min,其间振荡2～3次,使痰液化。取前处理消化后痰液0.1ml,无菌操作接种于罗氏培养基斜面上,每份标本同时接种两支培养基,放37℃孵育。接种后3～7d观察,此后每周观察一次菌落生长情况,有菌落生长需经抗酸染色确认是否为结核分支扦菌。若至第8周仍无菌落生长可报告阴性结果。3.2改良胰胨大豆蛋白胨L型菌培养基（tryptone soybean tryptone ager, TSA-L）培养法[6]收集肺结核确诊病人痰样本,采用碱处理法进行前处理,痰液中加4%NaOH约2～4倍量,振荡器振荡1min后,室温放置15-20min,其间振荡2～3次,使痰液化,再加无菌生理盐水至约40ml,离心10min,去上清,再用无菌生理盐水洗一次,余约0.5ml,取此前处理液0.1ml,无菌操作接种于改良TSA-L上,均匀涂布后置5%CO2恒温培养箱中37℃培养6周。每周肉眼观察1次,若有可疑菌落,显微镜下观察菌落形成情况。平板上一般先出现颗粒状（G型）幼小菌落,由十几个到数十个球状体组成。随时间延长,典型“油煎蛋”状（L型）菌落逐渐增多。培养时有时亦可见丝状菌落（F型菌落）。出现菌落时即可涂片抗酸染色镜检。无菌落生长者盲刮检查可提高阳性率。3.3本研究改进的MTB-L培养基培养方法（以下简称"MTB-L培养基培养法”）对TSA-L培养基配方进行改进,加入有利于分枝杆菌生长的胆固醇和卵磷脂等特殊营养成分。收集肺结核确诊病人痰样本,采用碱处理法进行前处理,痰液中加4%NaOH约2～4倍量,振荡器振荡1min后,室温放置15～20min,其间振荡2～3次,使痰液化,再加无菌生理盐水至约40ml,离心10min,去上清,再用无菌生理盐水洗一次,余约0.5ml,取此前处理消化后痰液0.1ml,无菌操作接种于改进的MTB-L培养基上,均匀涂布后置5%CO2培养箱中37℃培养6周。接种后第3和7日观察培养情况,此后每周肉眼观察1次,若有可疑菌落,显微镜下观察菌落形成情况。平板上一般先出现颗粒状（G型）幼小菌落,由十几个到数十个球状体组成。随时间延长,典型“油煎蛋”状（L型）菌落逐渐增多。培养时有时亦可见丝状菌落（F型菌落）。出现菌落时即可涂片抗酸染色镜检。无菌落生长者盲刮检查可提高阳性率。3.4方法学评价取50例经荧光定量PCR法确诊的MTB-L标本,分别采用罗氏培养基、改良TSA-L培养基和MTB-L培养基进行培养,比较其培养阳性检出率及阳性菌落形成所需时间。4改进的MTB-L培养基的临床应用采用MTB-L培养法对深圳市罗湖区慢性病防治院2010年1月至2011年12月期间收治的960例结核病确诊患者及其治疗期间MTB-L培养阳性样本进行4个抗结核病一线药的药物敏感试验,分析MTB-L对4个一线药品的耐药情况。5MTB药物敏感试验采用罗氏药敏培养基对深圳市罗湖区慢性病防治院2010年1月至2011年12月期间收治的960例结核病确诊患者及其治疗期间MTB培养阳性样本进行4个抗结核病一线药的药物敏感试验,分析MTB对4个一线药品的耐药情况。统计学处理1MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法及改良IK抗酸染色法与荧光定量PCR法MTB-L阳性检出率比较,分别采用配对设计的两样本率的卡方检验（McNemar配对法）,校正检验水准a’=0.05/3=0.017。统计学软件为SPSS13.0, P<校正检验水准a’为差异有统计学意义。2MTB-L抗酸染色法分别与Z-N抗酸染色法、改良IK抗酸染色法的MTB、 MTB-L阳性检出率结果比较采用配对设计的非参数检验（McNemar配对法）,校正检验水准a’=0.05/2=0.025。初治及复治结核病患者治疗期间MTB、MTB-L阴转率比较,均采用成组设计的两样本率的卡方检验,校正检验水准a’=0.05/3=0.017。统计学软件为SPSS13.0,P<校正检验水准a’为差异有统计学意义。3MTB-L培养基和TAS-L培养基MTB-L培养阳性率检测结果比较采用配对设计的非参数检验（McNemar配对法）；两种培养法培养MTB-L阳性所需天数采用x士s表示,两者比较采用成组设计t检验。统计学软件为SPSS13.0, P<0.05为差异有统计学意义。4MTB-L培养基培养法和TAS-L培养基培养法的涂阳培阴率比较采用配对设计的非参数检验（McNemar配对法）,初治及复治结核病患者治疗期间MTB、MTB-L耐药率比较,均采用成组设计的两样本率的卡方检验。统计学软件为SPSS13.0, P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1荧光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、改良IK抗酸染色法和Z-N抗酸染色法特异度均为100%,荧光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的灵敏度依次为30%、26%和28%,均高于Z-N抗酸染色法（14%）。荧光定量PCR法MTB-L抗酸染色法和改良IK抗酸染色法的总有效率依次为41.7%、38.3%和40.0%,均高于Z-N抗酸染色法（28.3%）。2100例痰标本经荧光定量PCR法、MTB-L抗酸染色法、Z-N抗酸染色法和改良IK法分析,MTB-L阳性检出率依次为30%、26%、14%和28%。MTB-L抗酸染色法MTB-L阳性检出率与荧光定量PCR法比较差异无统计学意义（Exact P=0.344>0.017）, Z-N抗酸染色法MTB-L阳性检出率显著低于荧光定量PCR法（Exact P=0.000<0.017）,改良IK法MTB-L阳性检出率与荧光定量PCR法比较差异无统计学意义（Exact P=0.688>0.017）32010年度468例结核患者经检测,MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率分别为59.0%、26.9%,改良IK抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率分别为57.5%、27.6%,Z-N抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率分别为38.5%、16.0。MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率与改良IK抗酸染色法比较差异均无统计学意义（P=0.092>0.025; P=0.549>0.025）; MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率均显著高于Z-N抗酸染色法,差异均有统计学意义（χ2=85.142, P=0.000<0.025;χ2=40.984, P=0.000<0.025）。42011年度492例结核患者经检测,MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率分别为60.8%、27.8%,Z-N抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率分别为39.2%、15.4%。MTB-L抗酸染色法MTB、MTB-L阳性检出率均显著高于Z-N抗酸染色法,差异均有统计学意义（χ2=96.711, P=0.000<0.025;χ2=50.704, P=0.000<0.025）。52010年1月至2011年12月间初治结核病患者痰液经涂片抗酸染色检查,MTB阳性患者411例,MTB+MTB-L阳性患者130例,MTB-L阳性患者129例。经规范化治疗5个月后,除1例MTB-L阳性患者外,其余全部转阴。按《中国结核病防治规划实施工作指南》（2008年版）规范要求计算结核病涂阳患者2、3月末痰菌阴转率（痰菌阴转率=某月末累计痰菌阴转患者数/涂阳患者登记数×100%）。其中MTB阳性患者2、3月末阴转率均分别高于MTB+MTB-L阳性患者（χ2=115.330,P=0.000<0.017；校正χ2=32.889,P=0.000<0.017）及MTB-L阳性患者（χ2=120.031,P=0.000<0.017；校正χ2=33.178P=0.000<0.017）；而MTB+MTB-L阳性患者2、3月末阴转率与MTB-L阳性患者无显著性差异（χ2=0.037,P=0.848>0.017；χ2=0.000,P=0.983>0.017）。62010年1月至2011年12月间复治结核病患者痰液经涂片抗酸染色检查,MTB阳性患者12例,MTB+MTB-L阳性患者19例,MTB-L阳性患者13例。经规范化治疗4个月后,除2例MTB+MTB-L阳性患者和1例MTB-L阳性患者外,其余全部转阴。按《中国结核病防治规划实施工作指南》（2008年版）规范要求计算结核病涂阳患者2、3月末痰菌阴转率（痰菌阴转率=某月末累计痰菌阴转患者数/涂阳患者登记数×100%）。其中MTB阳性患者2月末阴转率分别略高于MTB+MTB-L阳性患者及MTB-L阳性患者,但无统计学差异（Exact P=0.032>0.017;Exact P=0.041>0.017）;MTB阳性患者3月末阴转率分别略高于MTB+MTB-L阳性患者及MTB-L阳性患者,但无统计学差异（Exact P=0.363>0.017;Exact P=0.593>0.017）;MTB+MTB-L阳性患者2、3月末阴转率与MTB-L阳性患者均无显著差异（均exact P=1.000>0.017）。750例MTB-L阳性标本在含不同卵磷脂和胆固醇浓度的MTB-L培养基上生长情况不一致,以卵磷脂加入量≥0.6g和胆固醇加入量≥0.6g时生长状况最佳,因此,卵磷脂和胆固醇的最小加入量均为0.6g。8MTB-L培养法MTB-L阳性检出率为30.6%,改良TAS-L培养法MTB-L阳性检出率为23.9%,MTB-L培养法MTB-L阳性检出率显著高于改良TAS-L培养法（χ2=23.077,P=0.000<0.05）,同时其培养MTB-L阳性所需时间显著缩短（t=14.851,P=0.000<0.05）。9分别采用改良TAS-L培养法和MTB-L培养法对281例涂片染色MTB-L阳性标本进行分离培养,两种方法（?）培阴率[涂阳培阴率=（涂阳培阴例数/涂阳总例数）×100%]分别为9.3%和1.8（?）MTB-L培养法涂阳培阴率显著低于改良TAS-L培养法（P=0.000<0.05）10深圳市罗湖辖区MTB初治耐药率为22.4%,其中单耐药率为：INH4.7%、 RFP3.3%、EB1.7%、SM5.8%,多耐率为3.4%,耐多药率为3.7%；复治耐药率为33.3%,其中单耐药率为：INH5.6%、RFP5.6%、SM5.6%,多耐率为5.6%,耐多药率为11.1%。初治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为61.5%,其中单耐药率为：：INH23.1%、RFP5.1%、EB12.8%、SM10.2%,多耐率为5.1%,耐多药率为5.1%；复治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为40%,其中单耐药率为：INH20%,多耐率为20%,耐多药率为13.6%。11深圳市罗湖辖区MTB-L初治耐药率为46.7%,其中单耐药率为：INH11.9%、 RFP1.2%、EB11.0%、SM2.0%,多耐率为16.3%,耐多药率为4.5%；复治耐药率为46.7%,其中单耐药率为:INH10.0%、EB10.0%、SM3.3%,多耐率为16.7%,耐多药率为6.7%。初治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为46.6%,其中单耐药率为INH11.6%、RFP1.0%、SM1.9%,多耐率为17.5%,耐多药率为3.9%；复治结核病患者治疗2月末结核分枝杆菌耐药率为50%,其中单耐药率为：INH16.7%, EB16.7%,多耐率为8.3%,耐多药率为8.3%。12深圳市罗湖辖区MTB-L初治始耐药率（46.7%）显著高于MTB初治始耐药率（22.5%）（χ2=47.148,P=G.000<0.05）, MTB-L复治耐药率（46.7%）略高于MTB复治耐药率（33.3%）,但无统计学差异（χ2=0.823,P=0.364>0.05）。结果提示MTB-L的存在与耐药严重程度密切相关。研究结论1本研究改进的MTB-L抗酸染色方法具有良好的灵敏度、特异度,操作简便易行,适合于痰MTB-L常规检测,能够在基层结核病实验室推广应用。2本研究改进的MTB-L培养基配方简单、成本低廉,培养MTB-L所需时间短且细菌生长良好,适合MTB-L培养鉴定及其药物敏感试验,能够在基层结核病实验室推广应用。3本辖区初治和复治结核病患者中痰MTB阳性者转阴率高于MTB+MTB-L阳性者及MTB-L阳性者,MTB+MTB-L阳性者和MTB-L阳性者转阴率无明显差异。结果表明MTB-L是结核病患者阴转率低的重要原因,因此加强结核病患者痰MTB-L的检测是当前结核病防控的重要策略。4深圳市罗湖辖区MTB-L初治耐药率和复治耐药率均为46.7%,结果表明本辖区MTB-L耐药形势依然严峻,因此有必要加强结核病患者MTB-L的耐药性监测。5深圳市罗湖辖区MTB初治耐药率为22.5%,复治耐药率为33.3%,较2010年第5次全国结核病流行病学抽样调查初始耐药率42.7%,复治耐药率38.5%的水平低,结果表明深圳市罗湖辖区结核病防控维持在一个良好的水平。6深圳市罗湖辖区MTB-L初治耐药率和复治耐药率均分别高于MTB初治耐药率和复治耐药率,结果表明MTB-L的存在与耐药严重程度密切相关,因此有必要强结核病患者MTB-L感染及其耐药性监测。