水通道蛋白基因功能研究——AQP1在肿瘤血管生成中的作用及EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立

论文题目: 水通道蛋白基因功能研究——AQP1在肿瘤血管生成中的作用及EYFP-V163S体内水转运研究转基因鼠模型的建立

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 冯学超

导师: 麻彤辉

关键词: 水通道,基因打靶,血管生成,肿瘤生长,转基因小鼠,氯离子通道

文献来源: 东北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)是广泛存在于原核和真核细胞膜上转运水的特异蛋白孔道。自从九十年代初发现红细胞膜上的水通道蛋白(AQP1)以来,有关水通道蛋白结构与功能的研究取得了迅速的、系列性的进展。到目前为止已克隆的哺乳动物水通道蛋白家族有 13 个成员,其基因结构、基因表达调控、染色体定位、蛋白结构、组织分布和生理功能得到了较为深入的研究。对人类 AQP 基因突变和应用 AQP 基因敲出鼠进行的大量研究表明水通道蛋白在体内液体转运生理中起重要作用。关于 AQP 基因功能的研究正在不断深入,并与体内液体转运生理以外更为广泛的生理和病理过程联系起来。本研究对 AQP1 在肿瘤血管生成中的作用以及应用动物转基因技术建立敏感的体内细胞膜水通透性测定模型进行了研究和探索。 AQP1 是唯一表达在内皮细胞上的水通道蛋白,负责内皮细胞跨膜和跨细胞高效水转运。AQP1 除了各种正常组织的微小血管的内皮细胞上高度表达,还在多种肿瘤的微小血管中表达,提示 AQP1 可能参与肿瘤血管的生成。本研究应用 AQP1 敲除小鼠研究了 AQP1 在肿瘤血管生成和肿瘤发生中的作用。以 C57BL/6J 背景的 AQP1 敲除鼠为研究对象,将高恶性黑色素瘤细胞 B16-F10(来源于 C57)按 2×105/只的接种量背部皮下接种,12 天后取瘤称重,固定并进行病理分析,结果显示 AQP1 敲除小鼠肿瘤比 AQP1 野生型小鼠的肿瘤小近 30%;AQP1 在野生型小鼠黑色素瘤血管内皮细胞上高表达,而在 AQP1 敲除小鼠肿瘤血管内皮细胞呈阴性表达。在病理结构上,黑色素瘤细胞围绕血管分支呈岛状分布。野生型小鼠黑色素瘤内血管分布密度较高,管腔较细小;而 AQP1 敲除小鼠黑色素瘤内血管密度较低,管腔粗大,围绕血管的肿瘤细胞岛周边坏死区域明显大于野生小鼠肿瘤。基于 CD31 染色的血管密度统计结果表明:AQP1 野生小鼠肿瘤血管的平均密度为 142 个/mm2 ,而敲除小鼠的平均密度则为 47个/mm2 ,两者相差极为显著。可见,AQP1 在肿瘤血管生成中发挥重要作用,其机制值得进一步研究。本论文另一部分工作是建立表达对氯离子敏感的绿色荧光蛋白突变体 EYFP-V163S的转基因小鼠模型。目的是用于水和氯离子跨膜转运的体内研究。到目前为止,由于缺乏体内研究手段,人们对水和氯离子跨膜和跨细胞转运的研究主要是通过对体外培养的细胞研究来实现的;对水通道和氯离子通道的理论知识也主要是基于对体外细胞研究,缺乏在体组织细胞膜水分子和氯离子通透性的直接研究。为了更深入地研究水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况,完善水通道和氯离子通道的理论知识,同时实现体内各组织细胞对水和氯离子跨膜和跨细胞运输情况的系统研究,急需发展体内研究手段。随着生命科学从基因研究到功能研究的转变,发展体内研究手段更显重要。所以,建立对氯离子浓度极为敏感的 EYFP-V163S 的转基因小鼠模型,实现对水和氯离子跨膜转运的体内研究具有重要的意义。建立全身性高表达 EYFP-V163S 的转基因小鼠模型,利用该动物模型,通过器官组织体内原位灌注和动态荧光记录,可以实现对各种组织细胞膜的水和氯离子通透性直接测定。同时也可将各种表达 EYFP-V163S 的组织细胞进行体外培养建系,将之作为水通道或氯离子通道调节剂筛选和功能测定模型。本研究以氯离子敏感且特异性很强的 EYFP-V163S作为目的基因,采用基因敲入技术,将 EYFP-V163S基因定点整合到小鼠 E14 胚胎干细胞基因组的管家基因 ROSA26 位点中,借助该基因的强启动子表达 EYFP-V163S。利用双筛选策略构建打靶载体,大大地提高了打靶效率,使其阳性率达到 60%。建立稳定表达 EYFP-V163S 的 E14 胚胎干细胞株并通过显微注射,将其导入到囊胚腔,目前已获得两只嵌合体鼠,但是转基因传代未能成功。PCR 检测结果显示,EYFP-V163S 主要分布在大脑、骨骼肌、心脏、肾脏及肺血管中,睾丸则为阴性,进一步的免疫组化也证实 EYFP-V163S 主要在上述的五种器官或组织中表达,在大脑中表达最强,肾小管中表达最弱,睾丸为阴性。这说明 ES细胞未能进入嵌合体鼠的生殖系统,本研究正在用不同的 EYFP-V163S 干细胞克隆进行囊胚注射,以期最终获得生殖细胞转染的 EYFP-V163S 转基因鼠。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 AQP1 在肿瘤血管生成中的作用研究

第一部分引言

一、水通道蛋白的发现、命名及分类

二、水通道蛋白的组织分布、表达及调控

三、水通道蛋白的分子结构

（一）水通道蛋白的初级结构

（二）水通道蛋白的高级结构

四、水通道蛋白的生理和病理学意义

（一）水通道在肾脏尿浓缩生理中的作用

（二）水通道在消化生理中的作用

（三）水通道在神经生理中的作用

（四）水通道在呼吸生理的作用

（五）水通道在眼球生理中的作用

（六）水通道在皮肤生理中的作用

（七）水通道在肌肉生理中的作用

五、水通道蛋白未来基础研究和临床应用前景

六、AQP1 与肿瘤血管生成的关系

（二）肿瘤血管生成

（二）水通道蛋白基因1（AQP1）与肿瘤血管的形成

七、本研究的目的与意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）主要生化和分子生物学试剂

（二）细胞系

（三）主要实验仪器

（四）实验动物

二、实验方法

（一）细胞培养

（二）细胞计数及细胞活力测定

（三）肿瘤细胞接种

（四）瘤体收获及固定

（五）免疫组化及血管密度测定

第三部分实验结果

一、B16F10 细胞培养及其活力测定结果

二、AQP1(-/-)小鼠和 AQP1(+/+)小鼠黑色素瘤瘤体大小测定结果

三、AQP1 抗体免疫染色黑色素瘤的结果

四、CD31 抗体免疫染色黑色素瘤及肿瘤血管密度测定结果

第四部分讨论

一、AQP1 敲除抑制肿瘤新生血管生成的机制

二、AQP1 抑制剂可能成为抑制肿瘤血管生成的新型抗肿瘤药物

结论

第二章 EYFP-V1635 小鼠转基因模型的建立

第一部分引言

一、绿色荧光蛋白及其突变体的分子特性

（一） GFP 的分子结构特性及发光机制

（二） GFP 的光谱特性

（三） GFP 的改进

（四） EYFP－V163S 的分子特性

二、动物转基因与基因打靶

（一）动物转基因研究概况

（二）转基因动物的制备方法

（三）基因同源重组—基因打靶

三、ROSA26 基因位点的特性及其在动物转基因中的应用

四、本研究的目的及意义

第二部分实验材料与方法

一、实验材料

（一）主要化学及生化试剂

（二）培养基

（三）血清

（四）酶类

（五）细胞系

（六）细菌菌株

（七）实验仪器及耗才

二、实验方法

（一）培养基及溶液的配制

（二）打靶载体的构建及制备

（三）干细胞的培养及操作

（四）胚胎的显微操作

（五）转基因小鼠的鉴定与传代

第三部分实验结果

一、ROSA26Targeting-EYFP-V163S打靶载体的构建策略

（一） ROSA26Targeting-EYFP-V163S打靶载体的构建策略

（二） ROSA26Targeting-EYFP-V163S打靶载体的构建结果

二、ES细胞筛选鉴定结果

三、转基因小鼠的鉴定

第四部分讨论

一、EYFP-V163S转基因鼠模型的意义及应用

二、本研究得到的启示

结论

参考文献

主要英文缩写词表

致谢

作者简介

发布时间: 2005-07-07

参考文献

[1].水通道蛋白1在恶性肿瘤中的作用及功能研究[D]. 秦凤霞.天津医科大学2017
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