脂多糖对A549细胞SP-B表达的影响及其机制

论文摘要

表面活性物质B（surfactant protein B,SP-B）是肺泡表面活性物质的基本成分,起着减小肺泡表面张力的作用,对于出生后呼吸适应是必需的。目前多认为:表面活性物质的缺乏能引起新生儿呼吸窘迫综合征（neonatal respiratory distress syndrome, NRDS）,以肺内形成透明膜为其主要病变特征,而SP-B是其中最重要的一种。在早产儿肺透明膜病中,SP-B缺乏的主要机制为肺泡Ⅱ型上皮细胞发育不成熟。然而,足月新生儿及成人呼吸窘迫综合征的发生机制十分复杂,至今尚未阐明。基因突变、严重感染、缺氧等因素都可能引起。SP-B的转录受多种信号通路、激素、细胞因子等因素的调节。近年来研究表明,维甲酸在促进肺的发育、调控表面活性蛋白B（surfactant protein B, SP-B）基因表达方面有着重要作用。有研究报道,肿瘤坏死因子α（tumor nectosis factor-α, TNF-α）是一种致炎细胞因子,在肺的炎症性疾病中水平升高。TNF-α也可以抑制肺内表面活性磷脂和表面活性蛋白的合成,并抑制NCI-H441细胞内SP-B启动子的活性,提示其也在转录水平影响SP-B基因的表达[1]。而TNF-α的作用通常由核转录因子κB（nuclear transcription fator-κB, NFкB）的激活而被介导。感染是引起肺损伤和呼吸功能障碍的常见原因,LPS是细菌内毒素的主要成分,可刺激组织细胞并导致多种炎性物质（包括细胞因子）释放、诱导炎症反应。临床资料表明严重感染与新生儿及成人呼吸窘迫综合症均有密切关系,弄清其确切的发病机制对于我们选用合适的药物进行针对性治疗十分重要。感染是否能通过NFкB的变化来影响SP-B的表达,或通过其他机制影响SP-B的表达,国内外尚未见明确报道。目的通过检测LPS处理后A549细胞SP-B、NFкB、RAR-α表达与分布变化,探讨感染与RDS的关系及其有关机制,为临床预防和治疗感染相关性RDS提供新的思路和实验依据。方法A549细胞分为对照组和实验组,实验组分别用不同终浓度的LPS（5μg/ml;10μg/ml;15μg/ml）[2,3]处理24h。观察培养细胞的形态学改变,免疫细胞化学法检测SP-B和RAR-α在各组中的表达与分布变化;免疫荧光标记、激光共聚焦显微镜观察NFкB在各组中的表达与分布变化。结果1.细胞形态学表现:对照组A549细胞为多角形、胞质丰富,细胞突起明显,贴壁性生长,融合成片,无核固缩;LPS处理组（浓度:10μg/ml）A549细胞胞体变圆,体积缩小,突起减少,胞质内出现大小不等的颗粒。2.免疫细胞化学染色结果:①实验各组SP-B的表达:三个实验组SP-B的表达分别为0.1256±0.01898;0.0894±0.02230;0.0553±0.01466,均较对照组SP-B的表达（0.2252±0.05345）减弱,差异有统计学意义（P<0.05）.②实验各组RAR-α（胞核）的表达:三个实验组A549细胞核内RAR-α的表达分别为0.2931±0.01362;0.2068±0.01458;0.0946±0.05506,均较对照组（0.3692±0.03096）减弱,差异有统计学意义（P<0.05）.③实验各组RAR-α（胞质）的表达:三个实验组A549细胞质内RAR-α的表达分别为0.0888±0.01023;0.1499±0.01323;0.2152±0.01531,均较对照组（0.0206±0.01546）明显增强,差异有统计学意义（P<0.05）.3.免疫荧光染色-激光共聚焦显微镜成像结果:NFκB红色荧光颗粒在对照组A549细胞的胞质中呈均匀弥漫分布,细胞核内无表达;经终浓度为10μg/ml的脂多糖处理24h后,NFκB红色荧光颗粒出现细胞核中表达。结论1.脂多糖在引起A549细胞形态学损伤变化的同时,也能引起SP-B表达下调。2.脂多糖引起的SP-B表达下调,可能与其诱导的NFκB核转位、RAR-α核内表达下调及胞质转位有关。3.感染因素可能通过NFκB介导的炎症反应通路和RA-RAR信号通路影响肺泡表面活性物质形成而引起RDS。

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• 结论
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