趋化因子SDF-1和fractalkine诱导经静脉注射移植的人骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区的迁移

论文摘要

缺血性脑卒中是严重威胁中老年人健康和生活质量的重要疾病,干细胞移植是促进脑损伤修复和改善神经功能的具有实际应用前景的治疗手段。作为较理想的供体细胞,骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植在实验性脑缺血的研究中已被证明有明确的保护作用,但缺血局部微环境如何促进BMSCs趋向病灶迁移的确切机制仍不明确。趋化因子是一类结构和功能相关的多肽超家族,基本功能是诱导表达有相应受体的细胞的定向迁移。有研究提示趋化因子与其受体的作用可能参与促进移植的BMSCs在体内的定向迁移。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）和fractalkine是为数不多组成性表达于中枢神经系统的趋化因子。当中枢神经系统发生炎症、缺血和缺氧等损伤后,病灶周围SDF-1和fractalkine表达上调,分别作用于其特异性受体CXCR4或CX3CR1,可促进小胶质细胞向病灶的迁移和活化,募集循环系统中的单核细胞、自然杀伤细胞和T淋巴细胞等,发挥清除坏死组织和促进损伤修复的作用。另有研究发现BMSCs也表达CXCR4和CX3CR1。由此提示SDF-1/CXCR4和fractalkine/ CX3CR1可能参与诱导移植的BMSCs向损伤脑组织的定向迁移,但目前仍缺乏在体研究报道。本研究旨在观察SDF-1与其受体CXCR4以及fractalkine与其受体CX3CR1的作用是否参与诱导移植的人骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,hMSCs）向缺血脑组织的定向迁移,以进一步解释移植BMSCs向脑损伤局部迁移的可能机制。方法1.人骨髓间充质干细胞经静脉注射移植后向大鼠缺血性脑损伤区的迁移以密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化hMSCs,流式细胞仪检测细胞表面标记物进行细胞鉴定;采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）2h缺血/再灌注模型,于再灌注后24h经鼠尾静脉注射移植2×106 hMSCs;于移植后1d、3d和7d,取组织切片行小鼠抗人细胞核抗体mAb1281免疫组织化学染色,观察hMSCs在大鼠体内分布情况。2.大鼠脑缺血后SDF-1和fractalkine表达的变化线拴法制作大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）2h缺血/再灌注模型,采用real time PCR和免疫组织化学技术,观察脑缺血/再灌注后2d、4d和8d脑组织SDF-1和fractalkine mRNA和蛋白表达的变化。3.人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1的表达分离、纯化和扩增hMSCs,以real time PCR和western blotting检测hMSCs趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达情况;并模拟损伤微环境部分方面（低氧）培养hMSCs,观察趋化因子受体CXCR4和CX3CR1表达的变化。4.干扰CXCR4和CX3CR1基因表达对移植人骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区迁移的影响采用可表达CXCR4或CX3CR1基因特异性siRNA的慢病毒载体病毒颗粒,以MOI=20的载体病毒量感染hMSCs;流式细胞仪分析测定载体病毒对hMSCs的感染效率;real time PCR和western blotting检测CXCR4和CX3CR1表达情况了解载体病毒感染后表达siRNA的干扰效率;将MCAO模型大鼠分为CX3CR1-RNAi-LV感染hMSCs移植组、CXCR4-RNAi-LV感染hMSCs移植组、阴性病毒感染hMSCs移植对照组和载体溶液注射对照组,每组按照移植后1d、3d和7d不同的时间点分为3个亚组,各组大鼠于规定时间点行全身灌注固定,观察hMSCs（GFP阳性细胞）在脑组织的分布情况。结果1.人骨髓间充质干细胞经静脉注射移植后向大鼠缺血性脑损伤区的迁移hMSCs呈长梭形、漩涡状生长,用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD29和CD105阳性,CD14和CD45阴性;线拴法制作MCAO大鼠,术后Zea Longa五分制评分23分,TTC染色可见白色梗死区;hMSCs静脉移植后,在缺血/再灌注损伤侧脑组织中可观察到大量mAb1281阳性细胞,主要分布于缺血病灶周围区;在心、肝、脾、肺和肾等脏器以及损伤对侧脑组织中仅可观察到少量mAb1281阳性细胞散在分布。2.大鼠脑缺血后SDF-1和fractalkine表达的变化脑缺血/再灌注损伤2d、4d和8d组大鼠缺血侧大脑脑组织SDF-1 mRNA表达分别为正常对照组的2.285倍、2.543倍和1.710倍;fractalkine mRNA表达分别为正常对照组的1.154倍、2.453倍和1.341倍。免疫组织化学染色发现正常组大鼠脑组织中有SDF-1和fractalkine阳性表达,阳性细胞散在分布于皮质、纹状体等部位;脑缺血/再灌注损伤组大鼠脑组织SDF-1和fractalkine阳性细胞明显增多,损伤后2d、4d和8d组大鼠脑组织梗死灶周围区聚集大量SDF-1和fractalkine阳性细胞:SDF-1表达平均光密度由正常对照组的6.02±0.37,分别增高为37.8±1.30（2d组）、44.8±2.21（4d组）和30.6±1.08（8d组）;fractalkine平均光密度由正常对照组的5.77±0.57,分别增高为31.3±1.80（2d组）、43.1±7.63（4d组）和30.2±4.18（8d组）。3.人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4和CX3CR1的表达CXCR4和CX3CR1免疫细胞化学染色阳性表达分布于hMSCs的细胞膜和细胞浆;hMSCs在常规培养条件下有CXCR4和CX3CR1 mRNA表达,低氧条件下CXCR4和CX3CR1表达增高,分别为常规培养条件下的2.162倍（P<0.01）和2.524倍（P<0.05）;western blotting检测发现hMSCs在正常培养条件下有CXCR4和CX3CR1表达,低氧条件下CXCR4和CX3CR1表达显著增高:CXCR4表达由正常组的0.535±0.061增高为0.901±0.029（P<0.01）,CX3CR1表达由正常组的0.360±0.079增高为0.716±0.102（P<0.05）。4.干扰CXCR4和CX3CR1基因表达对移植人骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区迁移的影响流式细胞分析慢病毒载体对hMSCs感染效率均高于90%。阴性病毒感染组hMSCs CXCR4和CX3CR1 mRNA表达与正常未感染组hMSCs比较无显著差异（P>0.05）;CXCR4-RNAi-LV感染组hMSCs CXCR4 mRNA表达与正常未感染组hMSCs比较下降82.6%（P<0.01）;CX3CR1-RNAi-LV感染组hMSCs CX3CR1 mRNA表达与正常未感染组hMSCs比较下降了74.4%（P<0.01）。western blotting检测发现阴性病毒感染组和正常未感染组CXCR4和CX3CR1表达无显著差异;CXCR4-RNAi-LV感染组较正常未感染组CXCR4表达下降80.0%（P<0.05）,CX3CR1-RNAi-LV感染组较正常未感染组CX3CR1表达下降71.7%（P<0.05）。各组大鼠脑组织中均可观察到GFP阳性细胞,主要分布于缺血侧大脑半球病灶周围区;CXCR4-RNAi-LV感染hMSCs移植组和CX3CR1-RNAi-LV感染hMSCs移植组与阴性病毒感染hMSCs移植对照组相比,移植后1d、3d和7d,脑组织中GFP阳性细胞数量均显著减少（P<0.01）。结论1.静脉注射移植的骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区定向迁移;2.缺血性脑损伤区趋化因子SDF-1和fractalkine表达增高;3.骨髓间充质干细胞表达趋化因子SDF-1受体CXCR4和fractalkine受体CX3CR1;4.干扰SDF-1受体CXCR4或fractalkine受体CX3CR1的基因表达后,移植的骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区的迁移减少;5.趋化因子SDF-1、fractalkine与其特异性受体CXCR4、CX3CR1的相互作用参与诱导移植的骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区的迁移。

论文目录

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• 论文正文 趋化因子SDF-1 和fractalkine 诱导经静脉注射移植的人骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区的迁移
• 前言
• 第一部分 人骨髓间充质干细胞经静脉注射移植后向大鼠缺血性脑损伤区的迁移
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 大鼠脑缺血后SDF-1 和fractalkine 表达的变化
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 人骨髓间充质干细胞趋化因子受体CXCR4 和CX3CR1 的表达
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 干扰CXCR4 和CX3CR1 基因表达对移植人骨髓间充质干细胞向缺血性脑损伤区迁移的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 图片
• 参考文献
• 文献综述 移植骨髓间充质干细胞向损伤脑组织迁移的趋化机制研究进展
• 参考文献
• 博士期间撰写和发表的论文
• 英文论著