不同玉米骨干自交系氮素利用的差异蛋白质组学初步研究

论文摘要

玉米（Zea mays L）是世界上最重要的食粮之一,平均单产居首位。就目前全球情况而言,增加氮肥的施用量是提高玉米产量的一条重要措施。然而氮肥施用只能在一定程度上增加其产量,施用过量不但给生产者带来更多的经济负担,而且带来严重的环境问题。我国西南地区玉米主要种植于较贫瘠的土壤中。因此研究玉米的骨干自交系,尤其是对氮素反应敏感度不同的自交系,氮素利用差异的机理,有利于搞清楚玉米耐低氮品种在低氮胁迫下启动应急的机制,从而为选育高肥料利用效率品种奠定基础。本研究选取在育种中广泛应用玉米骨干自交系耐瘠薄的黄早四和不耐瘠薄的Mo17为材料。研究二者在无土栽培条件下以硝酸钙为唯一氮源且施氮浓度梯度为0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L下株型、干物质积累差异,并以双向电泳技术分别研究在上述栽培条件下黄早四、Mo17叶片蛋白质组表达的差异,得到以下结论:1.黄早四在前期的营养生长中株高叶面积不如Mo17,干物质积累量也比Mo17少,但是在后期成熟时的干物质积累总量和Mo17相当,生殖生长的干物质积累比Mo17多,并且每个生长时期黄早四在不同施氮水平间的差异表现均没有Mo17明显,黄早四在4mmol/L时能够获得与8mmol/L相近的生物学产量,据此推断黄早四比Mo17更具有耐瘠薄的特点。2.黄早四、Mo17在苗期和拔节期的各个施氮水平叶片表达的蛋白质组进行双向电泳分析,检测到各个时期Mo17表达的蛋白点均少于黄早四。这可能与黄早四比Mo17更耐瘠薄有关。分别分析相同自交系同一时期不同施氮水平的双向电泳图谱,对其中28个差异表达的蛋白点进行肽质量指纹图谱分析,结果表明28个蛋白中包括了大量的未知蛋白,其中27个蛋白点与玉米以外的其他植物种属同源。3.黄早四和Mo17拔节期均检验到1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基且这一蛋白的表达量在黄早四和Mo17中均随着施氮浓度的增加呈上升的趋势。在相同施氮水平下黄早四1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基表达量高于Mo17,这可能是黄早四比Mo17更耐低氮胁迫的原因之一。4.在黄早四苗期和Mo17的拔节期均检测到了半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白,证明半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白作为一种逆境诱导蛋白,对玉米氮素胁迫起作用。在黄早四苗期中半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白随着施氮浓度的增加表达量呈献上升的趋势,而Mo17拔节期的情况正好相反。这可能是黄早四对施氮水平较Mo17不敏感的原因。5.在Mo17拔节期检测到抗病基因编码的一类NBS-LRR蛋白,这种蛋白首次在玉米的氮素胁迫中被检测到。推测该蛋白对玉米对氮素的反应起作用。但这一蛋白质在氮代谢过程中的具体功能以及如何参与整个过程,还需要进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 玉米在生产上的重要地位
• 1.2 氮肥在农业生产中的利用
• 1.2.1 氮素在植物体内的作用及其调节机构
• 1.2.1.1 氮素在植物体内的作用
• 1.2.1.2 氮素调节机制
• 1.2.2 氮效率的概念
• 1.2.3 提高氮利用效率的途径
• 1.3 玉米氮高效利用研究进展
• 1.4 蛋白质组学研究进展
• 1.4.1 蛋白质组学的概念及重要作用
• 1.4.2 蛋白质组学的研究内容
• 1.4.3 蛋白质组学研究的相关技术
• 1.4.3.1 蛋白质的提取
• 1.4.3.2 混合样品的分离
• 1.4.3.3 蛋白质成分的分析与鉴定
• 1.4.4 双向电泳技术
• 1.4.4.1 双向电泳技术的原理
• 1.4.4.2 双向电泳技术步骤
• 1.4.4.2.1 样品制备
• 1.4.4.2.2 上样和等电聚焦
• 1.4.4.2.3 胶条的平衡
• 1.4.4.2.4 第二向SDS-PAGE
• 1.4.4.2.5 染色
• 1.4.4.3 双向电泳的结果分析
• 1.4.5 双向电泳技术在农作物研究中的应用
• 1.4.5.1 双向电泳技术在遗传育种中的应用
• 1.4.5.2 双向电泳技术在品质和产量中的应用
• 1.4.5.3 双向电泳技术在品种检验中的应用
• 1.4.5.4 双向电泳技术在逆境胁迫研究中的应用
• 1.4.5.5 作物—微生物互作与作物病害
• 1.5 本研究目的、意义及主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 无土栽培试验
• 2.2.2 施氮浓度梯度试验
• 2.2.3 样品蛋白质组的制备
• 2.2.3.1 玉米叶片蛋白质的提取
• 2.2.3.2 样品蛋白质的重融
• 2.2.3.3 制各样品中蛋白质浓度的测定
• 2.2.4 蛋白质二维凝胶电泳
• 2.2.4.1 胶条水合
• 2.2.4.2 第一向IEF等电聚焦
• 2.2.4.3 二维间平衡
• 2.2.4.4 第二向SDS-PAGE电泳
• 2.2.4.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 2.2.4.4.2 第二向电泳
• 2.2.5 二维电泳凝佼考马斯亮蓝显色
• 2.2.6 双向电泳电泳图谱分析
• 2.2.7 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质
• 2.2.7.1 蛋白肽段的提取
• 2.2.7.2 MALDI-TOF/TOF-MS分析
• 2.2.7.3 蛋白在数据库检索
• 3 结果与分析
• 3.1 各生育时期黄早四和Mo17在不同施氮水平下的株型表现
• 3.1.1 苗期黄早四和Mo17在不同施氮水平下的株型表现
• 3.1.2 拔节期黄早四和Mo17在不同施氮水平下的株型表现
• 3.1.3 成熟期黄早四和Mo17在不同施氮-水平下的干物质积累
• 3.2 双向电泳图谱差异分析
• 3.2.1 苗期黄早四蛋自质表达差异
• 3.2.2 苗期Mo17蛋白质表达差异
• 3.2.3 拔节期黄早四蛋白质表达差异
• 3.2.4 拔节期Mo17蛋白质表达差异
• 3.3 差异蛋白质点质谱分析结果
• 4 讨论
• 4.1 双向电泳方法的优化
• 4.1.1 增加蛋白质重融度
• 4.1.2 双向电泳条佯的优化
• 4.1.2.1 使用纯丙酮再次沉淀蛋白质
• 4.1.2.2 搭建了盐桥的双向电泳图谱比较
• 4.1.2.3 非线性PH梯度胶条能将样品更好的分离开
• 4.2 不同施氮水平下不同自交系植株性状差异
• 4.3 部分与玉米自交系氮素利用相关的蛋白质及其作用机制
• 4.3.1 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基
• 4.3.2 半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白（cysteine protein inhibitor）
• 4.3.3 NBS-LRR蛋白
• 参考文献
• 致谢