论文摘要
西方国家一直是大肠癌的高发国家,据Aemal等在2009年对西方一些发达国家做的一项癌症发病情况的统计数据显示,结直肠癌每年的新发病例以及死亡率都占恶性肿瘤的第三位,分别为10%和9%,男女之间无明显的差异；近年来随着我国人民生活水平的改善以及社会环境的改变,大肠癌在我国的发病率也呈现逐渐增高的趋势,目前发病率居消化道肿瘤的第三位,仅次于胃癌和食管癌。尤其在城市,大肠癌的发病率更高。目前大肠癌的治疗手段主要有手术、化疗、放疗三种。对于早期发现、可耐受手术治疗的患者及早行手术治疗是迄今为止能根治大肠癌的最佳方法,必要时辅以化疗或者放疗以提高5年生存率；对于失去手术机会的晚期大肠癌患者,化疗仍是一种控制肿瘤进展的方法,然而全身化疗不仅会杀伤肿瘤细胞,正常细胞也会受到损害；而放疗主要用于直肠癌的辅助治疗,在结肠癌的治疗中应用较少,同时放疗也可能导致严重的放射性结肠炎或者直肠炎,因而限制了放疗在大肠癌治疗中的应用。因此通过各项检测指标早期发现大肠癌、了解大肠癌的发生发展机制以及探寻新的治疗手段有望为根治大肠癌带来希望。磷脂酰肌醇3一激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）是一类特异的催化磷脂酰肌醇脂物质的激酶,是由一个催化亚单位和一个调节亚单位构成的异源二聚体,具有蛋白激酶和磷脂激酶双重活性；PI3K在肿瘤中的作用主要依赖其磷脂激酶活性,通过其磷脂激酶活性催化底物的第三位肌醇环而使相应的底物激活,在其激活的产物中以PIP3最为重要,PIP3作为第二信使与PDKl相互作用而磷酸化Akt（或PKB）,激活的Akt再通过其磷酸化作用而激活或者抑制其下游的与细胞周期、增殖、凋亡有关的效应分子,从而达到调节细胞增殖、生存等活动的作用。哺乳动物的PI3K家族主要有三型,在PI3K家族中,IA型PI3K由于其在肿瘤发生发展中的重要作用近年来备受瞩目。PI3Kp110β属于IA型PI3K家族中的一个亚型,与IA型PI3K家族中的其他成员一样,同时具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。作为脂质磷酸酶,PI3Kp110β可使4,5-二磷酸磷脂酞肌醇[PI（4,5）P3]转化为3,4,5-三磷酸磷脂酞肌醇[PI（3,4,5）P3],从而激活磷脂酰肌醇3—激酶的活性,进而激活下游效应分子Akt而参与调节细胞的增殖、生长、凋亡和存活等活动。研究表明PI3Kp110β表达抑制可引起PI3K/Akt通路活性的抑制,参与调控子宫内膜癌、前列腺癌、恶性胶质瘤及乳腺癌等多种实体瘤的生长及发展等活动。然而对于PI3Kp110β在大肠癌进展中的作用以及对大肠癌细胞的增殖、凋亡影响的研究尚未见报道。FoxO转录因子是Forkhead转录因子家族成员之,该家族的共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域,称为Fox（Forkheadbox）结构域。该家族成员主要受PI3K/Akt通路的磷酸化/去磷酸化修饰,磷酸化/去磷酸化改变FoxO蛋白的亚细胞定位。磷酸化的FoxO蛋白被排出细胞核,其转录活性受到抑制,这是负性调节FoxO转录活性的主要机制。肿瘤的发生与细胞周期失控及细胞凋亡机制异常密切相关,其中FoxO蛋白分子可能参与并发挥重要作用：①FoxO活性降低,细胞周期停止受到抑制,有助于肿瘤的发展；②FoxO活性降低,DNA损伤修复能力受损,可能导致基因组的不稳定；③FoxO蛋白表达缺乏,细胞正常的凋亡减弱,可能导致肿瘤的异常生长；④在人类染色体移位突变的肿瘤中发现有FoxO蛋白分子。目前关于PI3Kp110β表达变化引起大肠癌细胞生物学特性的变化与下游通路中FoxO转录因子家族变化及其所调控的细胞周期相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白表达变化的关系,未见报道。本研究在系统地检测PI3Kp110β在大肠黏膜正常组织-大肠增生性息肉-大肠腺瘤-原发性大肠癌组织中的表达差异和分布特点基础上,设计并合成了PIK3CB-siRNA干扰序列,转染大肠癌HCT116细胞,观察下调PI3Kp1lOβ表达后对大肠癌细胞增殖及凋亡的影响,同时检测了PI3K通路下游的Akt蛋白、细胞周期相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白及FoxO转录因子家族蛋白的表达变化,探讨PI3Kp11Oβ表达变化对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响及相关的信号机制,旨在为发现大肠癌基因治疗新的靶点提供理论依据。材料与方法一、PI3Kp110β在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义应用Westernblot法检测PI3Kp1l0p在大肠黏膜正常组织、大肠增生性息肉、大肠腺瘤以及原发性大肠癌组织中的表达情况,并分析PI3Kp110β表达变化在大肠癌发展过程中的意义。二、PI3Kp110β表达对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响1、大肠癌细胞株的筛选复苏大肠癌细胞株SW620、SW480、HCT116,细胞稳定生长后提取细胞总RNA和细胞总蛋白,分别行real time RT-PCR和Westernblot检测,从以上细胞株中选取PI3Kp11Oβ表达量最多的细胞进行后续试验。2、有效PIK3CB-siRNA干扰序列的筛选转染实验参照Invitrogen公司的Lipofectamine2000TM产品说明书进行,转染后48h进行细胞总RNA及细胞总蛋白的提取,分别行实时逆转录聚合酶链式反应（Real Time Reverse transcription polymerase chain reaction,QRT-PCR）和免疫蛋白质印迹（westernblot）检测转染后HCT116细胞PI3Kp110βmRNA和蛋白表达水平的改变,选取PI3Kp110β抑制率最高的一组干扰序列作为有效干扰序列进行后续试验。3、细胞增殖实验细胞经PIK3CB-siRNA转染后,各组细胞连续培养0h-72h,CCK-8法检测下调PI3Kp110β表达对大肠癌细胞HCT116增殖的影响。4、细胞凋亡实验采用AnnexinⅤ-FITC标记的流式细胞术和JC-1染色法检测下调PI3Kp11Oβ表达对大肠癌细胞HCT116凋亡的影响。三、PI3Kp110p表达参与大肠癌细胞增殖与凋亡的信号通路研究Westernblot检测下调PI3Kp110β表达后总蛋白中Akt1及p-Akt的表达水平的变化。作为PI3K/Akt信号通路的下游靶点,同时检测细胞周期相关蛋白cyclinD1、cdk4、cdk6的表达水平变化以及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bcl-6和FoxO转录因子家族蛋白的表达水平变化,即胞浆蛋白p-FoxO1（FKHR,Ser256）、p-FoxO3a（FKHRL1,Ser253）和胞核蛋白FoxO1（FKHR）、FoxO3a（FKHRL1）的表达变化。四、统计学分析所有结果均经SPSS13.0统计软件分析。数据以均数±标准差（χ±s）表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,细胞增殖采用析因设计的方差分析,组间多重比较方差齐性时进行LSD方法分析,方差不齐时进行Dunnett’ sT3方法分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果一、PI3Kp110β在大肠癌癌变过程中的表达及临床意义Westernblot结果显示在大肠正常黏膜、大肠增生性息肉、大肠腺瘤和大肠癌组织中PI3Kp110β蛋白表达有显著性差异（F=98.278,P＝0.000）。大肠癌中PI3Kp110β蛋白表达约为大肠正常粘膜组织的4倍。二、下调PI3Kp110β表达对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响1、PI3Kp110βsiRNA经酶切鉴定,所插入的片段与预期目的片段大小一致,并经测序证实,BLAST序列对比证实是PI3Kp110β基因mRNA序列。2、HCT116细胞经PIK3CB-siRNA转染48小时后,经real time RT-PCR和Westernblot检测转染后PI3Kp110βmRNA和蛋白表达的变化情况。与HCT116正常对照组及阴性对照组相比,HCT116 PIK3CB-siRNA组PI3Kp110βmRNA及蛋白表达均显著降低。3、应用CCK-8法连续检测各组细胞0h-72h的增殖情况,结果显示,与对照组细胞相比,转染24h、48h、72h时PIK3CB-siRNA组的HCT116细胞增殖速度减慢,差异具有统计学意义（F=107.719,P=0.000）,说明下调PI3Kp110β蛋白表达可显著减慢HCT116细胞的恶性增殖。4、转染48小时后经JC-1染色法观察HCT116细胞线粒体膜电位的变化情况,转染PIK3CB-siRNA序列的HCT116细胞荧光共聚焦显微镜下呈绿色荧光,而阴性对照组细胞呈红色荧光,两组之间的线粒体膜电位变化存在差异。5、流式细胞术进一步检测细胞凋亡率,结果显示细胞经转染48h后PIK3CB-siRNA组细胞较阴性对照组细胞的早期及晚期凋亡率均显著增高,为阴性对照组细胞凋亡率的2倍,差异具有统计学意义（t=21.055,P=0.000；t=28.908,P=0.000）,说明下调PI3Kp110β蛋白表达可显著增加大肠癌细胞的凋亡率。三、PI3Kp110β表达参与大肠癌细胞增殖与凋亡的信号通路研究通过（?）Vesternblot检测PI3K下游参与细胞增殖与凋亡的信号通路蛋白的变化。结果显示,与阴性对照组细胞相比,转染PIK3CB-siRNA的HCT116细胞的p-Akt的表达量显著降低（t=132.539,P=0.000）,说明下调PI3Kp1100蛋白表达可以显著降低有活性的Akt蛋白的表达。作为Akt的下游靶蛋白,FoxO转录因子家族参与细胞增殖与凋亡的调节,Westernblot结果提示：与阴性对照组细胞相比,转染PIK3CB-siRNA序列的HCT116细胞胞核蛋白FoxO1（FKHR）表达量显著增加（t=-21.606,P=0.000）,而相应的胞浆磷酸化蛋白p-FoxO1（FKHR,Ser256）表达量显著降低（t=31.565,P=0.000）,说明下调PI3Kp110β蛋白表达可以促进FoxO转录因子家族中Fox01的胞核胞浆移位,使其胞核表达增加,从而促进下游参与细胞增殖与细胞凋亡的靶基因的转录。Westernblot进一步检测了FoxO转录因子家族蛋白表达变化对细胞周期相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的影响。结果提示：与阴性对照组细胞相比,转染PIK3CB-siRNA的HCT116细胞的细胞周期相关蛋白cyclinD1、cdk4表达显著降低（t=198.162,P=0.000；t=11.803,P=0.000）,细胞凋亡蛋白bcl-2、bax表达显著降低（t=107.456,P=0.000；t=34.995,P=0.000）。这些结果提示下调PI3Kp110β蛋白表达可以通过激活下游的FoxO转录因子家族成员,并引起细胞周期相关蛋白及细胞凋亡相关蛋白的改变,从而参与调节大肠癌细胞周期阻滞及细胞凋亡增加等生物学行为的改变。结论1、Westernblot检测结果显示PI3Kp110β表达从大肠正常黏膜-大肠增生性息肉-大肠腺瘤-大肠癌依次增高,提示PI3Kp110β在大肠癌的发生发展中起着重要作用。2、下调PI3Kp110β蛋白表达可以抑制大肠癌HCT116细胞的增殖。3、下调PI3Kp110β蛋白表达可以引起大肠癌细胞线粒体膜电位的降低,诱导细胞凋亡。4、下调PI3Kp110β蛋白表达可提高大肠癌HCT116细胞的凋亡率。5、下调PI3Kp110β蛋白表达可以降低Akt的活性,进而增强了Fox01转录因子的活性。Fox01转录因子活性的增加抑制了促细胞周期进展及细胞凋亡相关蛋白的表达。提示下调PI3Kp110β蛋白表达引起的大肠癌细胞增殖的抑制和凋亡的增加是与下游Fox01转录因子的激活密切相关的。