金属螯合色谱耦合人工伴侣辅助EGFP包含体蛋白质复性

论文摘要

在基因工程表达中,为了表达后纯化的需要,常常将融合标签（6×his）与目标蛋白质进行共表达,以利于金属螯合色谱（IMAC）对其进行分离复性。然而,在纯化和复性中,常会因样品局部浓度过高引起蛋白质聚集沉淀,而阻塞色谱柱及影响蛋白质的纯化和复性。为了减轻这些不利因素,开发有效和实用的包含体蛋白质的复性技术,本文将金属螯合色谱和人工伴侣系统相耦合,利用基因工程表达产物6×his标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）包含体,系统研究了耦合辅助复性作用,并与传统复性法进行了比较讨论。研究结果表明,稀释复性仅能使较低浓度（0.05 mg·mL-10.2 mg·mL-1）的包含体蛋白达到较好的复性效果（30%40%）,但当蛋白终浓度为0.6 mg·mL-1时,荧光复性收率仅为14%;人工伴侣辅助复性虽然可使复性收率有所提高,但蛋白终浓度为0.6 mg·mL-10.8 mg·mL-1时,也只能达到25%左右的荧光复性收率;IMAC可以使高浓度包含体蛋白复性收率明显提高,在复性蛋白终浓度为0.6 mg·mL-1时,荧光复性收率可达60%,质量收率达80%;若将IMAC与人工伴侣耦合,相同条件蛋白质的复性结果可进一步提高为荧光复性收率80%,质量收率82%。进一步对耦合辅助复性中关键操作参数进行优化后,即变性蛋白与CTAB的摩尔浓度比为1:5,结合时间为20min,复性缓冲液的流速为0.4 mL·min-1,复性缓冲液中脲浓度为1.5 mol·L-1,洗脱液中脲浓度为2.5 mol·L-1时,可使终浓度为0.8 mg·mL-11.0 mg·mL-1的目标蛋白质达到87%的荧光复性收率和91%的质量收率,并且即使在更高的进样蛋白浓度（5 mg·mL-1）下,仍可获得69%的荧光复性收率和66%的质量收率,充分显示了耦合辅助复性的优势和在实际应用中的潜力。此外,本文还通过体积排阻色谱和圆二色光谱对耦合辅助复性的产物进行了分析。结果表明,复性产物大多为单体EGFP,且产品的二级结构和天然态绿色荧光蛋白相近。而其它复性方法则含有较多的多聚体,且二级结构与天然蛋白有较大差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 包含体 （Inclusion Body） 蛋白的形成和提取
• 1.1.1 包含体蛋白的产生及理化性质
• 1.1.2 包含体蛋白的分离纯化
• 1.1.3 包含体蛋白的溶解变性
• 1.2 包含体蛋白质的体外复性
• 1.2.1 体外复性难点及策略
• 1.2.2 传统的复性方法
• 1.2.3 稀释添加复性
• 1.2.4 分子伴侣与人工伴侣辅助复性
• 1.2.5 色谱辅助复性
• 1.2.6 金属螯合色谱辅助复性
• 1.3 蛋白质复性研究中的一些检测手段
• 1.3.1 荧光光谱法
• 1.3.2 圆二色光谱法
• 1.3.3 其他方法
• 1.4 增强型绿色荧光蛋白
• 1.4.1 绿色荧光蛋白简介
• 1.4.2 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）简介
• 1.4.3 增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的研究现状
• 1.5 本文的主要研究内容和预期
• 第二章 金属螯合色谱耦合人工伴侣辅助复性
• 2.1 实验材料和设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 包含体蛋白质的表达及纯化
• 2.2.2 SDS-丙稀酰胺凝胶电泳检测表达产物
• 2.2.3 蛋白质含量的测定
• 2.2.4 6×his-EGFP 包含体蛋白质的变性溶解
• 2.2.5 6×his-EGFP 的定性检测及荧光复性收率的计算
• 2.2.6 EGFP 包含体蛋白质的稀释复性
• 2.2.7 人工伴侣辅助 EGFP 包含体蛋白质的复性
• 2.2.8 金属螯合色谱辅助 EGFP 包含体蛋白质的复性
• 2.2.9 耦合辅助 EGFP 包含体蛋白质复性
• 2.3 实验结果及讨论
• 2.3.1 EGFP 包含体蛋白质的提取及变性溶解
• 2.3.2 EGFP 活性蛋白的制备及性质鉴定
• 2.3.3 EGFP 蛋白质标准曲线的绘制
• 2.3.4 EGFP 包含体蛋白的稀释复性
• 2.3.5 人工伴侣辅助 EGFP 包含体蛋白复性
• 2.3.6 金属螯合色谱辅助 EGFP 包含体蛋白质复性
• 2.3.7 金属螯合色谱耦合人工伴侣辅助 EGFP 包含体蛋白复性
• 2.3.8 四种不同的复性方法的比较
• 2.4 本章小结
• 第三章 耦合辅助复性条件优化
• 3.1 实验材料和设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 EGFP 包含体蛋白质的变性溶解
• 3.2.2 金属螯合色谱耦合人工伴侣辅助复性
• 3.2.3 EGFP 蛋白的定性检测及荧光复性收率的计算
• 3.2.4 圆二色光谱分析
• 3.2.5 体积排阻色谱分析
• 3.3 实验结果及讨论
• 3.3.1 各种影响因素的优化
• 3.3.2 复性产物的结构分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 附录
• 参考文献
• 致谢