论文摘要
目的:肝纤维化（hepatic fibrosis）是肝脏在受到慢性损伤时细胞外基质（extracellular matrix,ECM）分泌与降解失衡,导致ECM在肝内过度沉积的病理过程,肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是各种致炎因子和ECM的主要分泌细胞,其激活、增殖是肝纤维化的关键环节。在生理状态下,ECM的合成和降解处于一种动态平衡,从而维持肝脏的正常结构。然而持续、过度的炎症反应则加重肝损伤,促进肝纤维化发生、发展。其中细胞黏附分子在细胞与细胞或细胞与ECM之间的黏附过程与炎症及纤维化进程密切相关。NF-κB是广泛存在于细胞内的信号转导通路,被各种刺激因素激活及随后发生的基因表达是肝纤维化发生过程中的关键步骤,这些基因包括:细胞间粘附分子（ICAM-1）、血管细胞间粘附分子（VCAM-1）等,因此我们建立了CCl4致小鼠肝纤维化模型,以探讨血管紧张素转换酶抑制剂依那普利和姜黄素单独应用及联合应用对肝细胞损伤和纤维化的保护作用和对NF-κB及其相关粘附分子表达的影响,以阐明它在抑制肝纤维化形成中的作用及分子机制,为开发有效的抗肝纤维化药物及在临床中的开发应用提供理论依据。方法:选用8周龄健康雄性昆明小鼠50只,随机分为5组:对照组、肝纤维化模型组、姜黄素治疗组、依那普利治疗组、姜黄素联合依那普利治疗组。适应性喂养1周后,除正常对照组外,各组均给予10%的CCl4橄榄油腹腔注射（5ul/g）,每周2次,正常对照组给予生理盐水腹腔注射（5ul/g）,每周2次,均注射10周。开始造模2周后对照组及模型组小鼠给予生理盐水灌胃,各治疗组小鼠分别给予姜黄素（100ug/g）、依那普利（10mg/kg）、及姜黄素联合依那普利（姜黄素100ug/g,依那普利10mg/kg）灌胃治疗,每周3次,治疗8周后处死。留取血清检测肝功能ALT、AST、和血清肝纤维化指标HA;留取部分肝组织10%中性福尔马林固定,石蜡包埋,苏木精-伊红（HE）染色及Masson染色观察肝组织病理学改变;免疫组织化学染色法观察肝组织NF-κB P65、IKB、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达;提取肝组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达。结果:1小鼠一般情况:对照组小鼠精神状态良好,活动自如,模型组小鼠精神萎靡,动作迟缓,体重明显下降;各治疗组小鼠的情况好于模型组。各组小鼠体重依次为:模型组（34.43±4.08g）<姜黄素治疗组（ 43.38±4.75g ） <依那普利治疗组（ 43.56±2.88g ） <联合治疗组（49.75±3.62g）<对照组（53.60±3.51g）,与模型组比较,各治疗组及对照组小鼠体重均有所增加且有显著差异（P<0.05）;对照组及联合治疗组小鼠体重高于姜黄素治疗组和依那普利治疗组（P<0.05）,结果有统计学差异;姜黄素治疗组与依那普利治疗组间及对照组与联合治疗组间小鼠体重比较无显著差异（P >0.05）。2血清学指标:模型组小鼠血清ALT、AST、HA明显升高,姜黄素治疗组、依那普利治疗组及联合治疗组ALT、AST、HA均有所升高,但均低于模型组,各组小鼠血清ALT水平依次为:模型组（155.29±21.56U/L）>依那普利治疗组（92.11±16.89U/L）>姜黄素治疗组（83.75±14.54U/L）>联合治疗组（47.50±9.17U/L）>对照组（26.60±5.22U/L）,对照组及各治疗组血清ALT水平均低于模型组（P<0.05）,结果有统计学差异;联合治疗组效果优于依那普利及姜黄素单药治疗组（P<0.05）,结果有统计学差异;依那普利治疗组与姜黄素治疗组间血清ALT水平无显著差异（P>0.05）。血清AST变化情况:各组小鼠血清AST水平依次为:模型组（205.29±15.86U/L）>依那普利治疗组（123.22±10.47U/L）>姜黄素治疗组（ 98.38±12.41U/L ） >联合治疗组（ 79.88±9.83U/L ） >对照组（65.20±16.41U/L）,各组之间比较均有统计学意义（P值均<0.05）;血清HA变化情况:各组小鼠血清HA水平依次为:模型组（1680.22±94.19ng/ml）>依那普利治疗组（ 869.89±110.53ng/ml ） >姜黄素治疗组（608.71±120.74ng/ml）>联合治疗组（396.13±78.17ng/ml）>对照组（144.20±37.09ng/ml）,各组之间比较均有统计学意义（P值均<0.05）。3肝组织病理学检测3.1肉眼观察:对照组小鼠肝脏呈红褐色,被膜光滑,质地柔软;模型组小鼠肝脏呈暗红色,颜色晦暗,表面颗粒感,质地较硬;各治疗组小鼠肝组织大体观察明显好于肝纤维化模型组。3.2光镜下观察3.2.1 HE染色:对照组小鼠肝脏肝小叶结构正常,肝板走行整齐,无炎细胞浸润及纤维组织增生;模型组肝组织小叶结构被破坏,可见肝细胞变性坏死,大量炎细胞浸润;各治疗组小鼠肝损伤较模型组减轻,模型组与联合治疗组及对照组差异有统计学意义（P<0.05）,依那普利治疗组与对照组间差异有统计学意义（P<0.05）。3.2.2 Masson胶原染色:对照组小鼠肝组织内仅在血管壁、汇管区有少量胶原纤维存在,无纤维组织增生及假小叶形成;模型组在汇管区可见大量胶原纤维组织增生,并可见假小叶形成;各治疗组纤维化程度均较模型组轻,模型组与联合治疗组及对照组差异有统计学意义（P<0.05）,依那普利治疗组与对照组间差异有统计学意义（P<0.05）。4免疫组化染色4.1肝组织NF-κB P65蛋白表达:对照组小鼠肝组织中较少表达NF-κB p65,模型组小鼠肝细胞核中NF-κB p65表达明显增强,胞浆内亦有表达,各治疗组NF-κB p65表达较对照组有所增加,但均少于模型组,各组水平依次为:模型组（2.20±0.10）>依那普利治疗组（1.18±0.13）>姜黄素治疗组（0.95±0.07）>联合治疗组（0.62±0.06）>对照组（0.42±0.06）,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。4.2肝组织IκB蛋白表达:对照组小鼠肝细胞浆内有较弱的IκB表达,细胞核内无表达;在模型组及各治疗组中表达均较对照组增加,其中联合治疗组阳性表达明显增加,以胞浆表达增多为主,模型组胞浆及胞核中均有表达,以胞核为主,但表达水平低于各治疗组,各组水平依次为联合治疗组（2.20±0.14）>姜黄素治疗组（1.35±0.12）>依那普利治疗组（1.08±0.07）>模型组（0.94±0.13）>对照组（0.50±0.06）各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。4.3肝组织ICAM-1蛋白表达:对照组肝组织仅肝窦内皮细胞有少量表达,模型组除上述表达增强外,肝细胞浆可见ICAM-1表达,阳性细胞多分布于汇管区、中央静脉周围,肝小叶内炎症细胞浸润区和坏死灶,各治疗组肝细胞ICAM-1阳性表达均较模型组减轻,各组水平依次为:模型组（2.02±0.09）>依那普利治疗组（1.61±0.08）>姜黄素治疗组（1.11±0.14）>联合治疗组（0.75±0.13）>对照组（0.36±0.1）,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。4.4肝组织VCAM-1蛋白表达:对照组肝组织内几乎无VCAM-1表达,随着炎症及纤维化的发展,肝窦内皮细胞及肝细胞浆中可见阳性表达。模型组在中央静脉、汇管区及炎症灶周围窦内皮细胞阳性表达增加,肝细胞浆内弥漫性阳性表达,各组水平依次为:模型组（1.66±0.11）>依那普利治疗组（1.12±0.10）>姜黄素治疗组（1.01±0.05）>联合治疗组（0.69±0.05）>对照组（0.26±0.08）,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。5 RT-PCR检测5.1肝组织ICAM-1 mRNA表达:与对照组相比,模型组肝组织中ICAM-1 mRNA表达明显增加,各治疗组表达高于对照组少于模型组,各组水平依次为:模型组（1.10±0.16）>依那普利治疗组（0.79±0.11）>姜黄素治疗组（0.69±0.13）>联合治疗组（0.42±0.08）>对照组（0.29±0.11）,与模型组相比,对照组及各治疗组表达水平均有统计学意义（P<0.05）;对照组及联合治疗组表达水平低于姜黄素或依那普利单药治疗组（P<0.05）,有统计学意义;对照组和联合治疗组间、姜黄素治疗组和依那普利治疗组间差异无统计学意义（P >0.05）。5.2肝组织VCAM-1 mRNA表达:模型组、依那普利治疗组、姜黄素治疗组、联合治疗组、对照组水平依次为:模型组（1.39±0.21）>依那普利治疗组（0.89±0.12）>姜黄素治疗组（0.81±0.12）>联合治疗组（0.54±0.10）>对照组（0.28±0.10）,对照组及各治疗组表达水平均低于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）;联合治疗组表达水平低于姜黄素或依那普利单药治疗组（P<0.05）,差异有统计学意义;姜黄素治疗组与依那普利治疗组间差异无统计学意义（P >0.05）。6肝组织纤维化程度与肝组织ICAM-1和VCAM-1蛋白的相关性分析:ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平与纤维化分期呈直线相关关系,纤维化程度越重,ICAM-1、VCAM-1蛋白的表达水平越高。结论:1小鼠经CCl4腹腔注射10周后可诱导典型的肝纤维化模型,且病理改变符合人类肝纤维化的特点。2肝纤维化的发生发展与NF-κB活性增加及其下游ICAM-1、VCAM-1的高表达密切相关,IκB的高表达则可以抑制肝纤维化的进展。3依那普利及姜黄素均可改善肝功能及肝组织纤维化及炎症坏死程度,具有抑制肝纤维化的作用。4依那普利及姜黄素均可能通过抑制NF-κB活性进而减少其下游基因ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达,减轻肝组织炎症及肝纤维化,而发挥对肝纤维化的治疗作用。5依那普利联合姜黄素给药对肝细胞的保护作用及对肝纤维化的治疗作用优于任一单药治疗,其机制可能与抑制NF-κB激活,减少ICAM-1、VCAM-1 mRNA表达有协同抑制作用有关。
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