SARS冠状病毒刺突蛋白S144-643的原核表达及其重要生物特性研究

论文摘要

严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）又称“非典型性肺炎”,或“非典”,主要表现为肺炎及渐进性呼吸衰竭,死亡率为10%左右。它于2002年11月在中国广东省首先爆发,然后迅疾传播至全球32个国家及地区,其病原为一种新的冠状病毒（SARS associated coronavirus,SARS-CoV）。目前尚无特效药物用于SARS治疗,正在研究的各种抗病毒方法包括:用模拟受体分子或病毒的受体结合蛋白封闭病毒受体相互作用、用小肽分子抑制病毒与细胞膜间的融合、用特定中和表位研制亚单位疫苗等。SARS-CoV刺突蛋白S1是与病毒主要受体血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）相结合的病毒蛋白,其受体结合功能区包括在第318-510个氨基酸残基间的193个氨基酸片段内,该片段同时包含多个中和表位。本研究通过克隆表达SARS-CoV的S1蛋白受体结合区,为SARS-CoV受体ACE2功能区鉴定提供手段;同时,用所表达的S1蛋白为靶蛋白,从噬菌体展示随机肽库中筛选特异性结合多肽,为病毒受体及抗原抗体相互研究及抗病毒研究提供理论依据。 本论文将S144-643的基因片段（nt430-nt1929）克隆入表达质粒pET-28b中,在大肠杆菌中原核表达了该段S1蛋白。S1蛋白以组氨酸标签标记,蛋白分子量为50KD左右,以包涵体形式存在于细菌中。Western blot证明,S144-643可以与SARS康复病人的阳性血清发生特异性反应,免疫新西兰大白兔可以诱发产生较高水平的特异性抗体,因而证明原核表达的S144-643具有良好的免疫原性。同时Western blot证实,S144-643蛋白能与病毒受体ACE2结合。结合杨国良ACE2的有关研究材料,证实ACE2 N端的335个氨基酸与SARS-CoV S1的结合相关。 经过His.Bind试剂盒纯化的S144-643蛋白作为靶蛋白,从十二肽库中筛选与其特异性结合的多肽。经过3轮筛选,并经过ELISA和Dot-blot分析,得到10个阳性噬菌体克隆。序列分析结果显示,这10个阳性噬菌体克隆多肽序列中具有明显的保守序列。假病毒中和试验初步证实,其中两个噬菌体具有病毒中和活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 冠状病毒的历史
• 1.2 冠状病毒分类
• 1.3 SARS冠状病毒的生物学特征
• 1.3.1 SARS冠状病毒的形态特征与理化性质
• 1.3.2 SARS冠状病毒（SARS-CoV）的培养
• 1.3.3 SARS冠状病毒的复制过程
• 1.3.4 SARS冠状病毒的基因组结构
• 1.4 冠状病毒刺突蛋白（Spike，S）的基本结构与功能
• 1.5 冠状病毒与细胞受体的相互作用
• 1.5.1 氨肽酶N
• 1.5.2 癌胚抗原细胞粘附分子（CEACAM）
• 1.5.3 唾液酸
• 1.6 SARS冠状病毒S蛋白结构及受体
• 1.6.1 血管紧张素转换酶2（ACE2）
• 1.6.2 CD209L（L-SIGN）
• 2 研究目的及意义
• 3 实验材料与方法
• 3.1 细菌、质粒及SARS阳性血清与健康人血清
• 3.2 主要生化试剂、试剂盒及材料
• 3.3 主要溶液的配制
• 3.3.1 抗生素类
• 3.3.2 细菌培养基
• 3.3.3 E.coli感受态制备用试剂
• 3.3.4 质粒抽提相关溶液
• 3.3.5 SDS-PAGE相关溶液
• 3.3.6 Western-blot相关溶液
• 3.3.7 ELISA相关溶液
• 3.3.8 包涵体提取相关溶液
• 3.3.9 His.Bind Purification Kit纯化相关溶液
• 3.3.10 蛋白质银染相关溶液（郭尧君，1991）
• 3.3.11 噬菌体展示相关溶液
• 3.3.12 其他试剂与溶液
• 3.4 主要实验方法
• 3.4.1 DNA片段的快速回收
• 3.4.2 感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.4.3 连接产物的转化
• 3.4.4 质粒的制备
• 3.4.5 重组质粒的鉴定
• 3.4.6 大肠杆菌BL21（DE3）的诱导表达
• 3.4.7 表达蛋白的鉴定
• 3.4.8 通过包涵体提取纯化表达蛋白
• 3.4.9 用His.Bind Purification Kit重组蛋白质纯化
• 3.4.10 兔抗S144-643高免血清的制备
• 3.4.11 最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定（方阵滴定）
• 3.4.12 ELISA检测免疫动物的抗体水平
• 3.4.13 噬菌体展示的操作流程与方法
• 3.4.14 假病毒中和试验
• 4 结果与分析
• 4.1 重组质粒p28b-S144-643的构建及鉴定
• 4.2 重组质粒在大肠杆菌中表达及可溶性分析
• 4.3 S144-643蛋白的纯化及免疫原性分析
• 4.4 ELISA检测最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定（方阵滴定）
• 4.5 免疫动物抗体水平的ELISA检测
• 1-367的结合'>4.6 SARS S144-643蛋白与ACE2_1-367的结合
• 4.7 噬菌体展示筛选与S144-643特异性结合多肽
• 4.8 假病毒侵染阻断试验
• 5. 讨论
• 5.1 SARS病毒S1蛋白
• 5.2 SARS病毒受体ACE2的功能区
• 5.3 SARS病毒其它受体
• 5.4 关于噬菌体展示结果
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢