N蛋白相互作用蛋白基因多态性与SRAS冠状病毒易感性的关系

论文摘要

严重急性呼吸系统综合征（SARS）是一种以呼吸系统症状为主要表现的传染性疾病,它的病原体为新型冠状病毒（SARS-CoV）。由于其传播速度快、致病性强、致死率高,已对全球造成巨大的危害。绝大多数传染性疾病都属于典型的多基因疾病,是致病微生物和宿主之间在长期的进化过程中交互作用的结果。而宿主的遗传因素在疾病的发生发展过程中起着非常重要的作用。SARS的临床研究表明约有20%的病人发病凶险,而另外80%的病人病情平稳,可以痊愈,即不同个体间存在发病严重程度的差异;结合以往的数个关联研究表明宿主的遗传因素在SARS冠状病毒致病过程中扮演了重要角色。本实验室在开展遗传因素在重大传染性疾病发生发展中的重要作用的研究中,探索了SARS-CoV的结构及其与宿主的相互作用,发现与作为SARS冠状病毒主要抗原分子的N蛋白相互作用的蛋白有甲胎蛋白A（AHSG）、细胞色素氧化酶（CYP4F3）和甘露糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶（MASP2）。本项研究以上述蛋白的基因作为候选基因,采取病例-对照关联研究的策略对SARS的遗传易感基因进行了筛查,以期对揭示疾病的发病机制、提高疾病的预防、诊断和治疗水平提供理论基础。本研究先对三个候选基因的外显子区、5’和3’侧翼区及外显子和内含子的交界区进行了重测序,并应用Haploview软件构建连锁不平衡模式,选择tag SNP和有潜在功能的位点进行关联研究。入选的病例-对照按地区来源分三个人群:北京非医源性SARS病例（272例）收集于小汤山医院,正常对照（424例）来自北京307医院等医院健康体检人群。广州非医源性SARS人群（67例）收集于广州第八人民医院,正常对照（192例）收集自广州军区总医院体检人员。广州医源性人群收集于广州中山大学二院医务工作人员（病例40例,正常对照122例）。非医源性病例339例均为汉族群体的散发病例,非医源性对照样品616例采自医院体检正常的汉族人群。对选择的SNP位点应用SNPstream技术进行了基因分型。然后登记分型数据,进行哈温平衡检验,分别经χ2检验分析组间的等位及基因型分布的差异,对于χ2检验存在显著性差异的位点进行Logistic回归分析,以校正年龄、性别因素的影响。应用荧光素酶活性检测对阳性关联位点进行了部分功能验证。应用SPSS 13.0软件进行统计分析。主要获得以下结果:（1）建立了SNP分型和遗传分析的技术平台。（2）首次发现AHSG启动子区-799A/T多态性位点及外显子区的rs4917和rs1071592位点的等位及基因型频率在非医源性病例和对照中存在显著的统计学差异。携带至少一个-799T（AT和TT）或rs4917T（CT和TT）等位的个体其患病风险分别高于携带-799AA或rs4917CC基因型的个体（OR=2.44, 95%CI=1.32-4.57, P=0.005; OR=1.59, 95%CI=1.21-2.08, P=0.001）。功能研究支持AHSG多态性位点与SARS-CoV感染的易感性相关联。已知AHSG是一种多功能蛋白,低水平AHSG与急性炎症有关,高水平的AHSG可抑制TNF-α的产生;AHSG还参与巨噬细胞的灭活,提高细胞摄取阳离子的能力以减少炎症因子如TNF-α、IL-1β和IL-6对细胞的损害。功能研究显示-799A/T处于转录因子AP-1结合区,与-799A相比,-799T与AP-1具有更强的结合能力,荧光素酶活性实验结果显示,-799A等位型比-799T等位型的转录活性高出1.86倍。经检测病例和对照个体血清中AHSG的含量,结果显示SARS病人AHSG含量显著低于正常对照。因此推测携带-799T等位的个体由于AHSG转录活性低及血清中AHSG的水平低,因而更易感染SARS-CoV。（3）揭示CYP4F3基因启动子区多态性位点-903A/G、-815A/G、-140C/T和位于内含子区的rs4646519以及由3个启动子区SNP位点构建的单体型[AGT]的频率在非医源性病例和对照中存在显著的差异。携带基因型-903AA或至少一个-815G（AG和GG）或-140T（CT和TT）等位的个体其发生SARS-CoV感染的风险分别显著高于携带-903GG、AG或-815AA或-140CC基因型的个体（OR=1.41, 95%CI=1.05-1.90,P=0.022;OR=1.81,95%CI=1.36-2.44,P=0.0001;OR=2.44, 5%CI=1.78-3.42, P=0.0001）。单体型分析显示,携带由启动子区三个位点的风险等位组成的单体型[AGT]的个体患病风险显著高于其它单体型。已知CYP4F3的重要功能是介导炎症介质白三烯B4 （LTB4）的氧化。LTB4是中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中花生四烯酸5-脂肪氧化酶的代谢产物,具有极强的中性粒细胞趋化和增活功能。如果CYP4F3的含量较高导致炎症因子LTB4在血液中的含量过低,不能激起有效的炎症反应,导致机体血管系统等的活体组织无法对病毒或其他损伤因子产生防御反应。检测单体型转录活性结果显示单体型[AGT]与其他单体型相比转录活性最高。-140C/T位于CYP4F3核心启动子区-179--90bp内,-140C等位的转录活性低于-140T。因此,本研究认为携带-140T等位的个体由于其高的CYP4F3转录活性,导致LTB4的含量低,因而更易感染SARS。AHSG基因的阳性关联位点与CYP4F3基因的多态性位点之间存在交互作用,可协同增加SARS-CoV感染的风险。（4）目前所得资料显示MBL途径中的重要蛋白MASP2基因的多态性位点与SARS-CoV感染的易感性未见有相关性。本研究中鉴定的与SARS-CoV感染易感性相关的基因为SARS疾病高危个体的早期筛查和先期预防提供了遗传标记,也将有助于疾病发病机理的阐明和未来诊断和治疗水平的提高。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写一览表
• 前言
• 1. 传染性疾病遗传易感性的研究背景
• 1.1 传染性疾病的遗传易感性的概述及分析方法
• 1.2 单核苷酸多态性及其分析方法
• 2.SARS遗传易感性研究现状及与SARS－CoV N蛋白相互作用蛋白的概述
• 2.1 SARS遗传易感性研究现状
• 2.2 SARS－CoV N蛋白相互作用蛋白的概述
• 材料与方法
• 1. 主要试剂、耗材及仪器
• 2. 研究对象
• 3. 基因组DNA的提取
• 4.SNP的发掘
• 5. 连锁不平衡图谱构建（LD block mapping）
• 6. 用于分型的SNP的选择
• 7. 应用SNPstream技术对SNP进行分型
• 8. 荧光素酶活性检测（Luciferase assay）
• 9. 血液中总RNA的提取及RT－PCR
• 10. 统计分析
• 11. 其它
• 结果
• 1. 基于单碱基延伸技术的SNP分型技术平台的建立
• 1.1 SNPstream技术对12 个SNP分型结果
• 1.2 SNPstream技术与PCR－直接测序法进行基因分型的结果比较
• 2. 入选样本的流行病学信息
• 3. 候选基因发掘SNP的结果分析
• 4. 候选基因LD的构建和用于分型的SNP的选择
• 5. 候选基因的多态性位点与SARS易感性的关联研究
• 6. 阳性关联位点功能的实验室验证
• 6.1 AHSG 基因 rs2248690（-799A/T）位点调节转录活性
• 6.2 CYP4F3 基因 rs1290616（-140C/T）位点及启动子区单体型对转录活性的影响
• 7.A HSG基因与CYP4F3 基因 SNP位点间交互作用分析
• 讨论
• 1. 基于单碱基延伸技术的SNP分型技术平台的优缺点
• 2. 候选基因进行SNP发掘的必要性
• 3.AHSG基因多态性位点与SARS易感性相关联
• 4.CYP4F3 基因多态性位点与SARS易感性存在关联
• 5.MASP2 基因多态性与SARS易感性无显著性关联
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢