钝齿棒杆菌产L-精氨酸供氧策略优化的初步研究

论文摘要

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸,是合成蛋白质肌酸的重要原料,也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物,具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛,导致市场对其需求量正不断增加。溶氧对于好氧发酵生产L-精氨酸来说,既是营养因素,又是环境因素,对菌体的生长和产物的形成都有重要影响。解决氧需求问题通常有两种方法:一是提高发酵过程中的溶氧水平,另一途径则是利用基因工程技术来提高细胞自身对氧气的利用率。本论文即将分别从这两方面优化L-精氨酸发酵的供氧策略。论文以钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum SYPA5-5为研究菌株,通过控制不同供氧条件的试验,考察发酵过程中供氧对L-精氨酸合成的影响。不同供氧条件下的L-精氨酸发酵特性的研究结果表明,发酵生产L-精氨酸对供氧有较高的要求,在发酵过程中需要消耗大量的氧气来维持细胞代谢和L-精氨酸的合成,氧的供应不足会严重抑制L-精氨酸的合成。对不同供氧条件下该菌株代谢流量分配进行分析后发现:高供氧（HOS）条件下,L-精氨酸的产量得到了提高。但是,在发酵的后半阶段,中供氧（MOS）比高供氧（HOS）更有利于稳定的L-Arg积累。因此,提出了两步法供氧控制策略,该策略先在发酵的初始阶段维持HOS条件,然后控制搅拌转速稳步下降,以维持一个稳定的溶氧改变。运用新的供氧策略后,L-精氨酸的产量达到36.6 g/L,比HOS和MOS分别增加了16%和51%,而且,葡萄糖的消耗速率的明显增加,发酵周期仅为81 h,比HOS条件下提前了6 h。C. crenatum SYPA5-5是革兰氏阳性工业用菌株,尚未见钝齿棒杆菌的遗传表达体系的研究报道。本论文以氯霉素乙酰转移酶基因（cat）作为报告基因,成功构建了含有不同启动子的重组表达质粒,并对其在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中的启动子活性进行了研究。结果发现,在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中启动子强度最大的都是tac启动子,lacZ次之,T7启动子强度最小,且T7在钝齿棒杆菌中不具有启动子功能。因而,确定下一步实验所用启动子为tac。在此基础上,成功构建了携带有来源于透明颤菌血红蛋白基因vgb的表达质粒pJC1-tac-vgb,并分别转入大肠杆菌JM109和钝齿棒杆菌SYPA5-5。利用CO差光谱法对重组菌表达的透明颤菌血红蛋白进行了活性及定量检测。并对重组菌SYPA5-5（pJC1-tac-vgb）的发酵特性进行了初步分析。结果显示,发酵过程中不加IPTG的重组菌的菌浓比原始菌提高了10.9%,产酸能力提高了13.0%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 L-精氨酸生物学意义及其应用
• 1.1.1 L-精氨酸的生物学意义
• 1.1.2 L-精氨酸的用途
• 1.2 L-精氨酸生产的国内外研究进展
• 1.2.1 L-精氨酸在传统诱变育种方面的研究进展
• 1.2.2 L-精氨酸在代谢工程育种方面的研究进展
• 1.3 代谢工程与代谢流量分析
• 1.4 透明颤菌血红蛋白研究进展
• 1.5 本课题的立题意义与研究内容
• 1.5.1 立题意义
• 1.5.2 立题内容
• 第二章 基于代谢流量分析的两步法供氧策略的提出
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 培养方法
• 2.2.5 分析方法
• 2.2.6 代谢流量计算方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 供氧控制模式对L-精氨酸发酵过程的影响
• 2.3.2 不同供氧模式对C. crenatum SYPA5-5 代谢流量分布的影响
• 2.3.3 基于代谢流量分析的新的供氧策略的提出及验证
• 2.4 本章小结
• 第三章 钝齿棒杆菌遗传表达体系的构建及初步评价
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 重组质粒的构建
• 3.3.2 钝齿棒杆菌的转化以及转化子的验证
• 3.3.3 启动子强度的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 透明颤菌血红蛋白基因VGB 在大肠杆菌和钝齿棒杆菌中的克隆与表达
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 重组质粒pET28a-vgb 的构建及转化
• 4.3.2 透明颤菌血红蛋白的纯化及纯化蛋白的光谱学活性检测
• 4.3.3 重组质粒pJC1-tac-vgb 的构建及转化
• 4.3.4 重组钝齿棒杆菌SYPA5-5（ pJC1-tac-vgb）的构建、筛选及鉴定
• 4.3.5 重组大肠杆菌JM109（pJC1-tac-vgb）和重组钝齿棒杆菌SYPA5-5（pJC1-tac-vgb）透明颤菌血红蛋白的光谱学活性检测
• 4.3.6 钝齿棒杆菌重组株与钝齿棒杆菌出发株的发酵特性比较
• 4.4 本章小结
• 结论与展望
• 结论
• 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文