论文摘要
急性排斥反应（acute rejection,AR）是影响移植肾长期存活的一个关键因素。也是引起早期移植物损害和长期的移植物功能障碍以及慢性移植物肾病的主要原因,而目前通常诊断肾移植术后发生急性排斥反应方法包括:1.病人临床体征,2.血肌酐、尿素氮等非特异性生化指标检查,3.移植肾影像学检查,4.移植肾穿刺病理活检。前3项检查指标只有当移植肾功能发生明显损伤后才能出现改变,并且这些改变都是非特异性的。组织活检虽然是确诊急性排斥反应的“金标准”,但穿刺活检可能导致严重的并发症,而由于活检取材部位的限制,并不能及时、全面的反应出移植肾的损伤情况。因此,目前临床急需筛选具有前瞻性、非侵入性和特异性的早期诊断AR的方法,以指导临床用药,提高移植肾的长期存活率尿液可以及时准确地反映整个肾脏的生理状态和功能水平,而且收集简单方便、是非侵入性诊断肾脏疾病的理想标本。器官移植排斥反应的发生是一种复杂的、动态的、多因素的病理过程,很难用传统单一的指标来准确反映。而蛋白质组是动态的,有它的时空性,能够在生命有机体整体水平上阐明生命现像的本质和活动规律。因此本课题以肾移植术后发生AR前、中、后各期的尿液作为研究对象,应用二维凝胶电泳-质谱技术（2-DE-MS）及Westernblot技术等,以期找到一组具有前瞻性和特异性的蛋白分子作为早期诊断的候选标志物。首先,我们根据尿蛋白的含盐高的特点优化了2-DE过程中等电聚焦程序,与Bio-rad操作手册推荐的等电聚焦方法相比,获得的尿液2-DE图谱点数由476个增加到564个。为充分去除尿液中的盐分,我们建立了尿蛋白丙酮沉淀三步法处理样品,结果显示尿蛋白丙酮沉淀三步法处理得到的样本在上述优化的等电聚焦条件下所获得的分离蛋白点更加清晰且圆,水平条带更少。说明本次研究建立的2-DE技术平台适用于尿蛋白研究。然后,为了消除尿蛋白样品的个体差异,本研究采取的是移植排斥反应前后患者自身样品的比较,即:排斥前3天相对光密度值与排斥后21天相对光密度值相比,选择表达量变化大于3倍（P﹤0.05）,并根据两个体取6个时相点即:-3/-2/-1/7/14/21天相对光密度值做趋势分析,应同时具有明显下降趋势的30个蛋白点进行鉴定。经MADIL-TOF-MS/MS成功鉴定出其中的16个蛋白,经文献复习、生物信息学和蛋白功能检索,从中筛选了与免疫排斥反应相关的3个蛋白,分别为α-1抗胰凝乳蛋白酶（alpha-1-antichymotrypsin ,AACT）,锌-α2糖蛋白（Zn-Alpha-2-Glycoprotein,ZAP）和肿瘤排斥抗原gp96（tumor rejection antigen gp96,gp96）,进行进一步临床样本免疫印记验证。对肾移植术后发生AR患者临床确诊排斥前3～5天（n=8）和未发生AR患者术后7天（n=10）尿液蛋白进行Westrenblot验证发现:以肉眼观察印记条带出现有无为判断标准,三个蛋白判定的准确率、敏感性和特异性分别为:AACT, 77.78%/100%/60%;ZAG, 77.78%/100%/60%;gp96, 83.33%/87.5%/80%。将三个蛋白各组的测定值与同组对照的比值,运用LINGO8.0软件进行统计学处理,得到三个蛋白的判断理论临界值[0.15, 0.35, 0.50],以此界值作为判别标准时,单一的ZAG可以将准确率、敏感性和特异性提高到100%/100%/100%,AACT准确率、敏感性和特异性分别达到94.4%/100%/90.00%;gp96准确率、敏感性和特异性分别达到88.9%/100%/90.00%。最后应用统计学建立优化模型对三个蛋白联合进行判别时,与原始病例实际结果的符合率达100%,但其确切的诊断价值还有待多中心大样本的临床试验确认。综上所述,我们的研究结果提示,联合应用AACT、ZAG和gp96三个蛋白临界值可作为早期诊断肾移植急性排斥反应的指标。