拟南芥及小立碗藓ADF家族的克隆和体外生化特性初探

论文摘要

在真核细胞中细胞骨架是维持细胞形态,支持各项细胞活动的重要成员。其中微丝骨架（actin cytoskeleton）是这一动态结构中的一大类,通过不断的聚合与解聚来体现它的功能。而这一功能是通过与众多的微丝结合蛋白相互作用实现的。ADF/cofilin家族是ABPs（actin binding proteins）中的重要成员,主要参与微丝的动态调控过程,受到诸多因素的影响,例如pH环境、浓度比例等。我们推测在拟南芥体内拥有12个ADF亚型（小立碗藓体内只有一个ADF基因）,它们在不同的发育阶段和不同的组织中表达,参与植株的诸多生理活动。在此,我们运用分子生物学的方法,克隆得到拟南芥ADF家族中的11个成员以及小立碗藓ADF的CDS序列,并将它们与pMD18-T载体和表达载体相连接,在原核系统中表达目的蛋白,使用亲和层析的方法将其纯化,并通过共沉淀验证它们与actin的相互作用关系,得到以下结果：1.通过PCR方法从野生型拟南芥幼苗cDNA中成功扩增出11个ADF基因（AtADF12除外）以及小立碗藓ADF基因。AtADF12有可能在某种特殊的生理条件下或一定环境条件下的某个器官中特异性表达（亦可能是假基因）,所以我们暂时未能扩增出AtADF12（At3g45990）。2.扩增出的基因在表达宿主（E. Coli BL21 DE3）可以诱导表达。将连接正确的表达载体转化表达宿主后,通过表达检测发现它们都可以产生目的蛋白。3.通过低速共沉淀实验发现AtADF11可以成束微丝；高速共沉淀实验发现PpADF和AtADF10可以剪切微丝,并且PpADF的剪切活性受pH和Ca2+调控。通过本实验的结果我们了解了ADF不同成员之间的功能差异,结合之前的许多工作,我们对ADF家族的功能有了进一步的认识,并对我们彻底揭示ADF家族功能奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 微丝细胞骨架
• 1.2 ADF/Cofilin蛋白
• 1.2.1 ADF/Cofilin蛋白的功能
• 1.2.2 ADF/Cofilin蛋白功能的调控
• 1.2.3 ADF/Cofilin蛋白结构
• 1.3 拟南芥ADF家族研究进展
• 1.3.1 拟南芥ADF家族的体内研究进展
• 1.3.2 拟南芥ADF家族的体外研究进展
• 1.4 其他植物ADF研究进展
• 1.5 本研究目的及意义
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、载体及工具酶
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 试剂、药品
• 2.1.4 缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥的种植和小立碗藓的培养
• 2.2.2 拟南芥总与小立碗藓RNA的提取
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 载体构建
• 第三章 结果与分析
• 3.1 拟南芥ADF家族和小立碗藓ADF进化树及氨基酸保守性分析
• 3.2 拟南芥ADF家族和小立碗藓ADF可预测理化性质的统计与比较
• 3.3 拟南芥ADF家族和小立碗藓ADF CDS的PCR扩增
• 3.4 PCR产物与pMD18-T载体连接
• 3.5 表达载体的连接
• 3.6 ADF蛋白的表达检测
• 3.7 AtADF10的纯化及生化特性验证
• 3.7.1 AtADF10的纯化
• 3.7.2 AtADF10剪切并且不成束F-actin
• 3.8 AtADF11的纯化及生化特性验证
• 3.8.1 AtADF11的纯化
• 3.8.2 AtADF11成束并且不剪切F-actin
• 3.9 PpADF的纯化及生化特性验证
• 3.9.1 PpADF的纯化
• 2+调控且不具成束功能'>3.9.2 PpADF剪切F-actin活性受到pH和Ca²⁺调控且不具成束功能
• 3.10 讨论
• 第四章 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 研究生期间发表文