论文摘要
研究背景:肠易激综合征（Irritable Bowel Syndrome,IBS）是一种常见的功能性肠病,其病因和发病机制并不清楚,目前公认IBS是多因素疾病。IBS病理生理学基础是肠道动力异常和内脏高敏感性。单胺类神经递质5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）是肠神经系统重要的神经递质,参与肠道感觉、动力、分泌的调控。本实验室前期在脑-肠交互作用理论基础上,建立了慢急性联合应激IBS大鼠模型,即动物在接受慢性不可预知轻度应激（CUMS）后接受一次急性束缚应激,已证实可从肠道动力、感觉和心理行为多方面模拟IBS表现,且具有稳定与重复性好的特点。本研究在前期对5-HT与NE在IBS动物模型研究的基础上,将应用慢急性联合应激动物模型完善对5-HT与NE系统的研究并进行新的探索研究,整个研究分为三部分。研究目的:1、通过测定各组大鼠感觉传导通路上脊髓背角、海马、额叶等脑—肠轴层面神经元c-fos水平,从分子水平评估慢急性联合应激动物模型。2、完善与深入探讨5-HT系统和NE系统在IBS的变化与可能的作用机制。3、利用蛋白质组学观察18S脑-肠交互作用动物模型结肠蛋白质全景,初步探讨IBS这一功能性肠病有无蛋白水平的变化。材料与方法:选用健康雄性成年Wistar大鼠,分为对照组、急性应激组（急性束缚1小时）、慢性应激组（CUMS,21天不可预知轻度应激）、慢急性联合应激组（联合应激组,CUMS的基础上给予急性束缚应激）。观察不同应激状态下的大鼠一定时间内糖水摄取量、排便颗粒、直肠扩张时腹肌收缩次数的变化,对模型进行再评价。采用免疫组织化学方法检测各组大鼠额叶、海马、脊髓背角、结肠c-fos水平;免疫组织化学方法检测各组大鼠结肠嗜铬细胞（EC）,甲苯胺蓝染色检测大鼠结肠肥大细胞（MC）及活化肥大细胞百分比（活化MC%）;免疫组织双染方法检测各组大鼠结肠酪氨酸羟化酶（TH）及其活化程度;Western Blot方法检测各组大鼠结肠TH蛋白水平;实时RT-PCR方法检测各组大鼠结肠和人类结肠粘膜TH-mRNA和c-fos-mRNA水平;MALDI-TOF-MS技术检测各组大鼠结肠蛋白指纹图谱。结果:1.联合应激大鼠额叶、海马、脊髓背角Fos蛋白明显高于对照组（P=0.026,0.002,0.013）;结肠Fos蛋白略高于对照组（P=0.205）;而与慢性应激大鼠相近（P=0.733）。急性应激大鼠中枢（额叶、海马、脊髓背角）与结肠c-fos-mRNA、Fos蛋白与对照组亦无显著差异（P＞0.05）。2、联合应激可使大鼠结肠分泌5-HT的EC和MC增多,MC活化脱颗粒,5-HT合成增加（P＜0.05）,5-HT含量亦增多,但对结肠5-HT代谢的其他指标无显著影响。急性应激组结肠MC无明显变化,而脱颗粒MC%明显升高,EC较对照组增多（P＞0.05）;慢性应激组结肠EC、MC和脱颗粒MC%增多;结肠TPH1 mRNA明显增高,结肠5-HT阳性细胞数增多（P＜0.05）。3、联合应激大鼠结肠NE含量显著增高,TH蛋白、TH-mRNA有升高趋势（P=0.590,0.363）;急性应激组结肠NE无明显变化,TH蛋白、TH-mRNA有增高趋势（P＞0.05）;慢性应激大鼠结肠NE含量有减低趋势,TH蛋白、TH-mRNA无明显变化（P＞0.05）。4、结肠5—HT系统和TH间相关系数无统计学意义（P＞0.05）。5、腹泻型IBS患者结肠粘膜TH和c-fos mRNA表达高于对照组（P=0.466,0.110）,便秘型IBS患者结肠粘膜TH—mRNA低于IBS-D,而与对照组无明显差异（P＞0.05）。6、联合应激大鼠与对照组问有明显差异（P＜0.05）的蛋白质/肽质量差异峰18个,与慢性应激大鼠间有10个,与急性应激大鼠间有1个,全部为联合应激组上调。各应激组之间的差异蛋白有一定重复性。结论:1、联合应激大鼠脑-肠轴各层面尤其是脊髓背角、海马Fos蛋白显著升高,而单纯急性应激模型Fos蛋白无明显升高,提示慢急性联合应激模型不同于单纯急性束缚应激模型,是可以部分模拟脑-肠交互作用的动物模型,为从分子水平研究IBS脑-肠交互作用提供平台。2、动物与人结肠标本研究显示:慢性应激调动机体5-HT系统和NE系统处于活跃状态,在此状态下,5-HT系统和NE系统对新的急性应激的反应较正常增强,5-HT和NE总量增多,前者通过抑制5-HT降解,后者则通过NE合成增加实现。在机体对慢急性联合应激的反应中,肠道局部以5-HT系统作用为主导,NE系统则起辅助作用。提示精神因素对其它刺激有一定放大作用。3、M/Z为4011.172、29150.9、15213.25Da的蛋白/肽峰,在各组间均存在差异。应激越强,蛋白表达量越高。这三个蛋白质/肽峰可能最有意义。