骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究

论文摘要

临床研究目的:通过建立原发性骨质疏松症患者不同证型（肾阴虚和肾阳虚）的OB体外培养体系,探讨骨质疏松症患者OB的基因表达谱与不同证型的相关性,为骨质疏松症中医证型的研究提供直接的实验资料,为骨质疏松中医证型实质和病情分级的研究提供合理的客观量化依据,为中医药防治OP的临床研究建立必备的评估系统和提供科研资料,同时为中医“肾主骨”理论提供实验资料。方法:收集临床病例24例,共分为3组。其中:正常对照组8例,骨质疏松症肾阴虚组和肾阳虚组各8例。所有病例资料均来自湖南省长沙市及周边地区2007年5-10月在中南大学湘雅二医院关节外科住院的患者。待患者分别行手术治疗后,取患者股骨头松质骨以改良酶消化法作人成骨细胞体外分离培养。所培养的人成骨细胞经过鉴定合格以后,每例患者选2瓶培养细胞,加入Trizol溶液转移至无RNA酶离心管中,冻存于-80℃冰箱备用。成骨细胞收集完毕以后,按Illumina公司的Trizol试剂盒操作程序,以Trizol一步法抽提肾阴虚组、肾阳虚组和正常组成骨细胞的总RNA。使用QIAGEN公司的QIAGEN RNeasy?Kit进一步纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳（180V,0.5h）检测总RNA的28s和18s比例,以评估总RNA的完整性;用分光光度计在260/280nm测定总RNA吸光度,以计算总RNA的纯度。按Illumina公司芯片制作要求,进行生物素标记的cRNA合成,并将其片段化处理,然后进行Illumina Sentrix芯片杂交。在对基因芯片进行质量控制和标准化之后,采用“Cubic Spline”标准化信号值,根据课题设计将样本分组,选择参考组,计算归一化信号值。一般选取｜DiffScore｜≥13（相当于ChangeP-value≤0.05）的点,认为是表达差异显著的基因,输出成《差异基因.xls》,作为初筛的结果,用于后续的分析。使用NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）、GENEONTOLOGY数据库（http://www.geneontology.org）以及KEGG数据库（http://www.biorcart.com）等工具查询相关差异基因的信息。结果:1.各组总RNA提取结果良好,总RNA的吸光度OD260/280值均在1.76-2.0,热稳定实验显示70℃lh与20℃lh电泳条带比较,28s条带无明显降解。RNA主要集中于0.5-2.0kb的连续条带。电泳结果证实己抽提高纯度的RNA。2.本实验结果完全符合Illumina基因芯片质量控制标准,信号强度达到要求。检测系统正常,保证了杂交结果的可靠性。3.以正常组为对照比较,筛选出肾阴虚与肾阳虚差异基因表达谱。通过对其进行生物信息学比对分析,筛选出在肾阴虚组和肾阳虚组中共同差异表达的基因419个。结论:1.有多种基因共同参与骨质疏松发生的整个过程。利用基因芯片技术分析不同中医证型基因表达谱变化,能够快速了解相关基因与不同证型的关系。2.对这419个差异表达基因功能分析有助于对骨质疏松发生机制的深入研究,为中医辨证论治提供相关依据。实验研究目的:本实验研究采用RT-PCR的检测方法观察中药骨康含药血清对肾阳虚型骨质疏松症患者成骨细胞细胞因子OPG和RANKL mRNA表达的影响,力求从细胞和分子水平探讨骨康抗骨质疏松的作用机制,为骨康在临床上防治骨质疏松提供有力的实验依据。方法:6月龄体重2.5～3.0kg的新西兰大耳白兔6只,雌雄各半,随机分为3组（中药骨康组、雌激素组、空白对照组）,每组2只。中药骨康组灌服1g/ml的骨康煎剂4.2ml/kg/d,雌激素组灌服0.01mg/ml浓度的倍美力2.4ml/kg/d,空白对照组给予与雌激素组等容积的生理盐水灌胃,1次/天,3组分别连续灌胃共7天,最后一次灌胃2小时后所有动物行心脏采血,收集血清备用。将分离培养的人成骨细胞消化传代,取第三代成骨细胞,制成2×105/ml的细胞悬液。所培养细胞分为7组（每组4瓶）,分别加入不同浓度（5%、10%、20%）的含药血清进行干预,对照组仅加培养液,继续培养。48h后用Trizol一步法提取总RAN,然后用RT-PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达。结果:5%骨康浓度组的OPG mRNA的表达量上升,与对照组比较有显著的统计学差异（P＜0.05）;10%、20%骨康组与对照组相比,OPG mRNA的表达量上升,具有非常显著性差异（P＜0.01）;并且10%与5%、20%与10%组间比较也有显著的统计学差异（P＜0.05）;20%骨康组与5%倍美力组比较无显著性差异（P＞0.05）。表明随着进行干预的骨康含药血清浓度的增加,体外培养的人成骨细胞OPG mRNA表达量的上调作用就越强,具有明显的浓度剂量依赖性。骨康含药血清以5%、10%、20%浓度递增时,RANKL mRNA的表达量下降,与对照组比较均有显著性的统计学差异（P＜0.05）,与5%倍美力含药血清相比较,均无显著性差异（P＞0.05）。并且10%与5%,20%与5%组间RANKL mRNA的表达量改变无显著性统计学差异（P＞0.05）;表明在药物干预过程中,骨康含药血清浓度递增时,对人成骨细胞RANKL mRNA的表达无明显影响。结论:实验表明,骨康可以上调肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞OPG mRNA的表达,下调成骨细胞RANKL mRNA的表达,从而抑制破骨细胞的产生和功能,为骨康防治骨质疏松提供了有力的实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献研究
• 第一节 原发性骨质疏松症的中医证型研究概况
• 1 中医证型的临床调查
• 2 中医证型本质的相关性探讨
• 3 对证型本质研究的评价与展望
• 第二节 成骨细胞的相关生物学特征研究概述
• 1 成骨细胞在体内的相关生物学特征
• 1.1 成骨细胞的起源与发展特征
• 1.2 成骨细胞的形态与结构特征
• 1.3 成骨细胞的标记物与表型特征
• 1.4 成骨细胞的主要功能特征
• 2 体外培养成骨细胞的一般生物学特征
• 2.1 原代及传代成骨细胞的形态学观察
• 2.2 成骨细胞活性检测与功能鉴定
• 2.3 体外培养成骨细胞骨形成主要基因表达特征
• 2.4 中药骨康对体外培养成骨细胞作用特征
• 第二部分 临床研究骨质疏松症患者成骨细胞基因表达与中医证型的相关性研究
• 第一节 肾阴虚和肾阳虚骨质疏松症患者临床资料收
• 1 资料收集对象与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二节 人体成骨细胞体外分离培养与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三节 人体成骨细胞总RNA抽提与测定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 第四节 基因芯片检测
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与分析
• 4 讨论
• 第三部分 实验研究 骨康含药血清对体外培养肾阳虚骨质疏松症患者成骨细胞OPG及RANKL mRNA表达的影响
• 第一节 材料与方法
• 1 中药骨康含药血清制备
• 2 体外人成骨细胞的复苏与传代培养
• 3 骨康对体外培养人成骨细胞的干预实验
• 4 成骨细胞总RNA的提取与鉴定
• 5 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
• 6 统计方法
• 第二节 结果
• 1 传代培养细胞的形态学观察
• 2 成骨细胞总RNA质量鉴定
• 3 人成骨细胞OPG及RANKL基因mRNA的表达
• 第三节 讨论
• 1 人成骨细胞体外传代培养体系的建立与药物干预的方法选择
• 2 中药骨康调控OPG、RANKL mRNA表达的机理探讨
• 结语
• 参考文献
• 附录一 缩略词汇表
• 附录二 主要试剂组成与配置表
• 在校期间发表的论文
• 致谢