Hspa5在斑马鱼早期胚胎发育中的作用

论文摘要

Hspa5为Hsp70家族的成员,它可以作为分子伴侣促进新合成蛋白质的折叠、组装及其跨过内质网膜的转运;使应激变性的可溶性蛋白质重新折叠;通过调节蛋白激酶或转录因子的活性而控制信号转导途径。在小鼠的早期胚胎发育中,Hspa5能保护内细胞团,阻止其凋亡。本文主要研究了斑马鱼Hspa5基因的表达模式及其调控,以及它在早期胚胎发育中的作用。结果表明,Hspa5 mRNA在卵子中就存在,是一个母源基因;其合子基因的表达开始于原肠中期的下胚层,在体节期发生在脊索和孵化腺中。在热刺激的条件下胚胎中Hspa5的表达明显增强,从而起到保护细胞的作用;抑制胚胎中Hspa5 mRNA的翻译可导致该基因的转录水平增高,表明存在反馈调控机制。尽管在胚胎中过量表达Hspa5对胚胎发育没有明显影响,但是利用反义吗啉环寡核苷酸抑制胚胎中Hspa5的表达会导致胚胎外包变得缓慢,24hpf出现尾部变细或卷曲、缺少腹鳍等背部化的表型,同时gsc和ntl等背部标记基因的表达增强,但eve1等腹部标记基因的表达减弱。这些结果说明,Hspa5不仅对胚胎的外包过程起一定作用,而且可以抑制背部组织的发育。进一步研究发现,抑制Hspa5的表达能够挽救Bmp2b过量表达所导致的胚胎腹部化,Bmp2b的过量表达可使阻断Hspa5表达所引起的背部化表型减弱,提示Hspa5在胚胎背腹分化方面的作用可能与Bmp信号相关。相关的详细机理还有待深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 文献综述
• 1.1 模式动物斑马鱼的优点
• 1.2 斑马鱼胚胎的早期发育过程
• 1.2.1 卵裂期（cleavage period）
• 1.2.2 囊胚期（blastula period）
• 1.2.3 原肠胚期（gastrula period）
• 1.2.4 体节期（segmentation period）
• 1.2.5 咽胚期（pharyngula stage）以及孵化期（hatching stage）
• 1.3 斑马鱼胚胎的背腹分化
• 1.4 BMP 信号通路
• 1.5 Hspa5 基因的研究现状
• 1.5.1 Hsps 基因家族
• 1.5.2 Hsp70 基因家族的特性及分类
• 1.5.3 Hspa5 基因
• 2 材料与方法
• 2.1 野生型斑马鱼的品系及喂养
• 2.2 相关质粒的构建及其用途
• 2.3 mRNA 的体外转录
• 2.4 反义吗啉环寡聚核苷酸的设计
• 2.4.1 吗啉环修饰的反义寡核苷酸的设计
• 2.4.2 吗啉环修饰的反义寡核苷酸的溶解与稀释
• 2.5 显微注射
• 2.6 探针的制备和整胚原位杂交
• 2.6.1 原位杂交探针的制备
• 2.6.2 原位杂交原理
• 2.6.3 原位杂交所需的材料和试剂
• 2.6.4 原位杂交的步骤
• 2.7 细胞的培养和转染
• 2.8 免疫印迹法检测蛋白的表达
• 2.9 胚胎的热激处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 Hspa5 基因相关质粒的构建
• 3.2 Hspa5 蛋白的保守性分析
• 3.3 Hspa5 基因在斑马鱼早期胚胎中的表达谱分析
• 3.4 Hspa5 基因表达的自我调节
• 3.5 热刺激对斑马鱼早期胚胎Hspa5 基因表达的影响
• 3.6 过量表达Hspa5 不会影响斑马鱼早期胚胎的正常发育
• 3.7 抑制Hspa5 基因表达对斑马鱼胚胎发育的影响
• 3.7.1 Hspa5 MO 的效果
• 3.7.2 抑制Hspa5 基因表达对胚胎外包的影响
• 3.7.3 抑制Hspa5 基因表达导致胚胎背部化
• 3.7.4 Hspa5 MO 与 Bmp26 过量表达的胚胎表型能够被互相挽救
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究生在校期间科研成果