环介导等温扩增技术检测水稻白叶枯菌方法的建立

论文摘要

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP）是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。本研究针对水稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）GeneBank收录号为AF169030的一段序列设计了一套特异性的引物,利用环介导等温扩增技术（LAMP）来扩增Xoo基因组DNA,扩增出一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,成功建立了LAMP检测Xoo的新方法。该检测方法特异性好、敏感性高而且节省时间。研究中分别设计了LAMP的不同引物浓度比、Mg2+浓度梯度、温度梯度、时间梯度等实验来优化反应条件,从而获知在内外引物浓度比为1:4、Mg2+添加浓度为4mmol/L、反应温度为63℃且反应时间为60min时检测最灵敏。将LAMP的浓度梯度实验和PCR的浓度梯度实验进行对比,发现LAMP对抽提的Xoo DNA最低检出浓度为46pg/tube,PCR对Xoo DNA最低检出浓度为4.6ng/tube,即LAMP技术的灵敏度是PCR的100倍。此外,LAMP能检测到直接裂解菌液中的DNA,而PCR却检测不到。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 立题的背景和意义
• 1.2 水稻白叶枯菌简介
• 1.2.1 水稻白叶枯菌生物学特征
• 1.2.2 水稻白叶枯菌基因组的总体特征
• 1.2.3 水稻白叶枯菌感染症状
• 1.3 水稻白叶枯菌检测方法研究现状
• 1.3.1 传统检测技术
• 1.3.2 血清学检测技术
• 1.3.3 聚合酶链式反应（PCR）及其衍生技术
• 1.4 环介导等温扩增（LAMP）技术概述
• 1.4.1 LAMP的基本特点
• 1.4.2 LAMP反应的特殊性及其反应体系
• 1.4.3 LAMP工作原理
• 1.4.4 环介导等温扩增技术（LAMP）的应用
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 仪器和设备
• 2.1.2 菌株和培养基
• 2.1.3 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验技术路线及LAMP主要操作
• 2.2.2 菌种的培养
• 2.2.3 Xoo基因组DNA的提取
• 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测DNA基因组
• 2.2.5 DNA浓度的测定
• 2.2.6 LAMP反应及引物设计
• 2.2.7 建立LAMP的反应体系
• 第3章 结果与分析
• 3.1 基因组DNA结果分析
• 3.2 LAMP分析
• 3.2.1 不同引物浓度比分析
• 2+浓度梯度分析'>3.2.2 Mg²⁺浓度梯度分析
• 3.2.3 不同Bst酶量分析
• 3.2.4 温度梯度分析
• 3.2.5 时间梯度分析
• 3.2.6 灵敏度分析
• 3.2.7 特异性的鉴定
• 3.3 裂解菌液检测分析
• 3.3.1 裂解菌液检测LAMP分析
• 3.3.2 裂解菌液检测PCR分析
• 第4章 讨论
• 4.1 LAMP检测体系的建立
• 4.1.1 目的基因和引物的确定
• 4.1.2 体系优化的确定
• 4.2 环介导等温扩增（LAMP）方法检测水稻白叶枯菌Xoo方法学评价
• 4.3 今后的进一步研究工作
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果