湖南省犬蠕虫感染情况调查及带绦虫分子遗传学研究

论文摘要

能寄生于犬的蠕虫约有120余种,其中人畜共患的约50余种。这些寄生虫不仅常引起犬腹泻、消瘦、贫血,尤其是幼犬,不仅使其生长发育受到影响,导致对其他疾病的抵抗力减弱,从而感染其它疾病,而且严重危害人类的健康。本研究的第一部分首次对湖南省来自9个地区的438只犬蠕虫感染情况进行了调查,结果显示绦虫感染率为42.68%,蛔虫感染率为45.43%,吸虫感染率为21.92%,犬钩虫感染率为7.3%。绦虫、蛔虫复合感染率为23.06%,绦虫、吸虫复合感染率19.18%,蛔虫与吸虫的混合感染率为21.92%。同时发现湖南犬绦虫的分布规律为犬复孔绦虫以岳阳、怀化和张家界感染率最高,达60%～100%;阔节裂头绦虫主要分布在湖南的湘西,且感染强度不大;曼氏迭宫绦虫以山区的张家界及湘西最高,感染率达60%;水泡带绦虫在山区的感染情况比较普遍,以张家界地区最多,感染率达30%;多头带绦虫和带形带绦虫主要分布在山区的怀化和湘西,感染率达20%～25%。豆状带绦虫整体感染率不高,仅3.42%。其它犬蠕虫在湖南的分布规律为钩虫在郴州的感染率最高,达29.03%,蛔虫的感染很普遍,主要是犬弓首蛔虫和狮弓蛔虫,在益阳感染率最高,分别达58%和41%。吸虫的感染主要为华枝睾吸虫,各地区均有分布,以郴州感染率最高,达51.61%。为更好地防治犬蠕虫病提供了重要的基础材料。本研究的第二部分对犬绦虫核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（ITS）序列进行了克隆及序列分析。首次获得了犬曼氏迭宫绦虫、水泡绦虫、多头绦虫的rDNA的ITS序列,其ITS序列总长为1200bp～1300bp（ITS-1为720bp,ITS-2为572bp）,G+C含量为53.99%～59.33%%。序列比对结果显示7个代表性犬绦虫样品（DM4XX,DM6YY,DM15ZJ,MM11JT,TH5XX,TH28CS,TPW2XX）的ITS-1、ITS-2序列存在较大差异,可分为四个种群,且种间相似性最高仅达41.6%和7.4%。即使是不同地方的同种也存在差异,种内相似性最高为98.3%和97.4%。由此可见,种间差异明显,种内也有一定差异。证明ITS序列可作为绦虫的遗传标记,填补了我国部分省份地区犬绦虫ITS序列的遗传变异情况研究的空白。本研究的第三部分对犬绦虫线粒体nad4基因进行了研究。根据绦虫的部分序列设计的一对引物,经过PCR扩增犬绦虫线粒体nad4基因序列,克隆及测序。获得6个代表性样品（MM11JT,TH29CS,TPW32CZ,TPW33CZ,TH45XX,TPW45）的核苷酸序列,序列长度均为523bp,经核苷酸序列互对比较,结果显示它们存在三个种群,且其种间差异为2.1%～30.1%,比种内变异（2.2%）大。种内变异均小于其与其它种种间的差异,能为种间鉴别提供遗传标记。本研究的第四部分对犬绦虫线粒体cox1基因进行了研究。根据绦虫的部分序列设计的一对引物,经过PCR扩增犬绦虫线粒体cox1基因序列,克隆及测序。获得8个代表性样品（TPW2XX,DM4XX,TH5XX,DM6YY,MM11JT,DM15ZJ,TH28XX,DM31CZ）的核苷酸序列,序列长度均为341bp,经核苷酸序列互对比较,结果显示它们存在四个种群,且四个种间cox1序列存在比较大的差异,为12.9%～30.3%,为7～85个碱基差异。种内差异曼氏迭宫绦虫碱基差异为0.0%～1.8%,其它种种内也仅存在1～4个碱基差异。由此说明,cox1基因序列为一段非常保守的基因序列,说明cox1基因非常适合作为绦虫分类的遗传标记。本试验首次对绦虫nad4和cox1基因的遗传变异情况进行研究,从线粒体基因的角度,开展绦虫线粒体遗传变异和DNA多态性方面的研究,找到了研究绦虫分子分类学、种群遗传关系有效的遗传标记,填补了我国寄生绦虫线粒体全基因组相关研究的空白。本研究的第五部分在国内首次建立了犬绦虫特异PCR检测方法,确定了对犬绦虫进行PCR检测时的最佳退火温度为65℃,最佳MgCl2浓度为3.0mM,此时,检测条带亮且没有非特异性条带出现。并且当样品DNA浓度被稀释640倍时,仍可出现清晰的条带。为该病的诊断和流行病学调查等提供了分子生物学方法,研究结果也为对绦虫进一步的深入研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 犬寄生虫病的研究进展
• 1.1 养犬的重要性
• 1.2 犬病、犬寄生虫病对犬生命及健康的重要性
• 1.3 世界各国犬寄生虫病流行情况
• 1.3.1 国外犬寄生虫感染概况
• 1.3.2 国外犬寄生虫感染主要优势种
• 1.3.3 国外不同种类犬的寄生虫感染情况
• 1.3.4 国外犬寄生虫感染中间宿主的感染情况
• 1.3.5 国外犬寄生虫感染终末宿主的感染情况
• 1.3.6 尼日利亚Kainji湖地区人和犬绦虫感染情况
• 1.3.7 国外用不同方法调查的犬寄生虫感染率
• 1.3.8 传播动力学研究
• 1.4 国内犬寄生虫病流行情况
• 1.4.1 国内不同地区犬寄生虫感染情况
• 1.4.2 国内不同地区犬寄生虫优势种情况
• 1.4.3 国内不同种类犬寄生虫感染率
• 1.4.4 国内犬寄生虫病不同检查方法寄生虫感染率
• 1.5 南省犬寄生虫感染情况
• 2 犬绦虫遗传变异及分子分类的研究进展
• 2.1 染色体分析
• 2.2 分子遗传学分析
• 2.2.1 PCR及其相关方法
• 2.2.2 研究中所用特定DNA序列的选取
• 2.2.3 rDNA、mtDNA在寄生虫学中的应用
• 3 研究内容与目的意义
• 3.1 研究内容
• 3.2 目的意义
• 第二章 湖南省犬蠕虫感染情况调查
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 犬寄生虫感染率
• 2.2 主要消化道寄生虫感染情况
• 2.3 寄生虫形态
• 2.4 粪检结果
• 3 讨论
• 3.1 湖南省犬消化道寄生虫感染情况
• 3.2 城市流浪犬与农村犬感染差异分析
• 3.3 不同检查方法的结果比较
• 第三章 犬绦虫rDNA ITS的PCR扩增、克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增绦虫rDNA ITS片段
• 2.2 ITS的克隆与鉴定结果
• 2.3 测序结果及分析
• 3 讨论
• 第四章 犬绦虫线粒体nad4基因部分序列多态性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增绦虫mtDNA nad4片段
• 2.2 重组nad4的菌落PCR鉴定
• 2.3 测序结果及分析
• 3 讨论
• 第五章 犬绦虫线粒体cox1基因部分序列多态性的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR扩增结果
• 2.2 测序结果及分析
• 3 讨论
• 第六章 犬绦虫特异PCR检测方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 特异PCR反应
• 2 结果与分析
• 2.1 特异PCR实验条件的优化结果
• 2.2 特异性试验结果
• 2.3 敏感性实验结果
• 3 讨论
• 3.1 特异性引物的设计问题
• 3.2 PCR实验条件的优化
• 3.3 敏感性问题
• 3.4 特异PCR方法的建立
• 第七章 结论与创新
• 1 结论
• 2 创新
• 参考文献
• 本论文常用英文缩写
• 附图1 质粒pGEM-T easy基因图谱
• 附图2 核糖体DNA重复序列
• 致谢
• 作者简介
• 攻读博士学位期间发表的学术论文目录