论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经退行性疾病,发病机制尚不清楚。临床和分子遗传学研究发现了几种呈单基因遗传方式的家族性帕金森病,并克隆了8个致病基因,其中常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征（autosomal recessive early-onsetparkinsonism,AREP）有3种基因型（PARK2、PARK6和PARK7）,致病基因分别是:parkin、PINK1、和DJ-1基因。PINK1基因是2004年克隆的PARK6的致病基因,被认为是继Parkin后第二常见的AREP致病基因,有一个由34个氨基酸组成的线粒体定位结构域,一个高度保守的激酶结构域,编码产生一种有激酶活性的线粒体蛋白,该基因的功能仍不清楚。前期的工作中我们已经发现了PINK1的2个新的致病突变,分别是Thr313Met和Arg492X,并将野生型、R492X突变型PINK1构建了真核表达载体,本研究将在前期工作的基础上,将构建好的野生型、R492X突变型PINK1-pcDNA3.1-myc-his（-）B真核表达载体转染SH-SY5Y细胞,获得稳定表达野生型、R492X突变PINK1蛋白的单克隆细胞株,研究在MPP+诱导/非诱导下野生型、R492X突变型PINK1蛋白与氧化应激、线粒体功能障碍以及在PD发病机制中的作用,主要研究内容如下:1.采用脂质体转染技术,建立稳定表达野生型、R492X突变型PINK1蛋白的SH-SY5Y单克隆细胞株,并在DNA、RNA、蛋白质三个水平鉴定所筛选的单克隆细胞株是否成功;2.MPP+诱导/非诱导下,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞早期凋亡情况,Hochest 33258荧光染色观察细胞核的变化;3.运用Western blot法分别检测MPP+诱导/非诱导下线粒体及胞浆内细胞色素C的含量,激光共聚焦显微镜下观察细胞色素C的释放情况;4.运用流式细胞分析系统、荧光分光光度计分别观察MPP+诱导/非诱导下细胞内活性氧（ROS）产生、线粒体膜电位改变及细胞内游离Ca2+浓度:5.2,6-dichloroindophenol（DCIP）作为最终的电子接受体,采用荧光分光光度计检测线粒体呼吸ComplexⅠ酶活性的改变;6.电子显微镜下观察细胞线粒体形态结构的变化。结果如下:筛选了稳定转染野生型及R492X突变型PINK1-pcDNA3.1-myc-his（-）B真核表达载体的SH-SY5Y单克隆细胞株,经DNA水平、RNA水平及蛋白水平的验证,证实了稳定表达野生型及R492X突变型PINK1蛋白单克隆细胞株的成功建立;在无MPP+诱导下,过表达R492X突变型PINK1蛋白促进线粒体细胞色素C释放、增加了细胞凋亡率、增加细胞内游离钙离子浓度、引起线粒体膜电位下降。在MPP+诱导下,过表达R492X突变型PINK1蛋白导致细胞活力下降、细胞线粒体细胞色素C的释放和细胞凋亡率增加、细胞内活性氧产生增加、游离钙离子浓度增加、线粒体膜电位下降、线粒体呼吸ComplexⅠ酶活性下降,线粒体肿胀变形,线粒体嵴断裂甚至消失。我们首次成功构建了稳定表达野生型、R492X突变型PINK1蛋白的转基因SH-SY5Y细胞模型,为PD发病机制的研究奠定了基础:证实了突变型PINK1蛋白可以促进线粒体细胞色素C释放和细胞凋亡、增加细胞内游离钙离子浓度、引起线粒体膜电位下降。在MPP+诱导下,突变型PINK1蛋白引起更明显的氧化应激和线粒体功能障碍,导致细胞活力下降、线粒体细胞色素C释放及细胞凋亡率增加、细胞内活性氧产生和游离钙离子浓度增加、线粒体膜电位和呼吸ComplexⅠ酶活性下降以及线粒体形态结构的改变。野生型PINK1具有细胞保护功能,可减少MPP+非诱导下的细胞色素C的释放,提高MPP+诱导下的ComplexⅠ酶活性;PINK1基因突变致使细胞对环境应激刺激更加敏感;进一步证实了环境因素与致病基因突变在PD发病机制中的协同作用。