沙柳再生体系的建立和农杆菌介导的rd29A基因转化国槐的研究

论文摘要

干旱、盐碱和低温是自然界普遍存在的抑制植物生长的因素,可引起植物体内许多生理生化指标发生变化,植物必须适应这些条件才能够生存,因此,如何开发和利用大面积的盐渍土或盐渍化贫瘠土地,不仅是我国增加农业可利用土地资源的需要,也是改善生态环境、增加绿色植被、提高森林覆盖率的需要。现代生物技术的发展为培育抗逆的作物品种提供了新方法和途径,已经成为改良盐碱地经济而有效的手段。沙柳和国槐是优良的多用途树种,我国各地均有栽培,具有重要的生态和经济利用价值。如能提高抗逆性,对退耕还林、发展畜牧业和改善生态环境具有十分重要的意义。本研究主要是建立沙柳再生体系,为基因工程育种奠定良好的基础;同时利用rd29A基因所具有的对干旱、盐碱和寒冷的抗御功能,以农杆菌为介导将其导入国槐中,以期获得抗旱、抗盐、耐低温的新品系,加大推广面积,改善生态环境。目前取得的主要研究结果如下:1、沙柳再生体系的建立（1）以带芽茎段进行无菌材料扩繁时,两种培养基交替使用效果最佳,即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖和MS+0.3 mg/L 6-BA+0.2mg/L KT+0.1 mg/L NAA+30g/L蔗糖的培养基交替使用,能使沙柳保持较高的繁殖系数,又可促使芽伸长,叶片伸展,颜色深绿;（2）以带叶柄的叶片为外植体,芽的诱导分为两步诱导,愈伤组织诱导培养基为MS+1.0mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30g/L蔗糖,需暗培养15d,愈伤组织诱导率高达100%;芽分化培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L KT+0.1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖; （3）根诱导培养基是1/2MS+20g/L蔗糖,生根率达100%。选取健壮幼苗经驯化炼苗15-20d后,大田成活率达90%以上。2、rd29A基因转化国槐的研究利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将rd29A基因转入国槐中。结果表明:（1）适宜外植体为接触培养基吸收较多营养而形成的肥厚大叶片;大叶片无需预培养;（2）农杆菌菌株GV3103优于LBA4404,适宜侵染浓度OD600为0.3;（3）用液体分化培养基活化农杆菌,侵染15min;（4）最佳共培养时间3d、共培培养基pH为5.5;（5） 400 mg/L头孢霉素可有效抑制农杆菌;（6）27℃下暗培养15d,延迟10～15d选择时,Kan和PPT能对转化体有效筛选。先用30mg/L Kan筛选一个月,再用3mg/L PPT筛选,将表现为抗性的幼苗切下,在50mg/L Kan生根培养基上筛选。3、转rd29A基因国槐植株的获得（1）对经卡拉霉素筛选生根的国槐抗性植株进行特异引物的PCR扩增,获得了2100bp的特异性片断,初步证明rd29A基因已整合到国槐基因组中;（2）转基因国槐植株在含0.6-0.8 %浓度的NaCl培养基上生长正常,而未转基因植株不能正常生长,转基因植株的耐盐性明显提高。

论文目录

• 主要英文缩略词表
• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 林木基因工程研究进展
• 1.1 抗病基因工程
• 1.1.1 真菌病抗性的研究
• 1.1.2 细菌病抗性的研究
• 1.1.3 病毒病抗性的研究
• 1.2 抗虫基因工程
• 1.3 抗除草剂基因工程
• 1.4 抗逆性基因工程
• 1.4.1 抗旱耐盐基因工程
• 1.4.2 抗寒、抗冻基因工程
• 1.4.3 耐重金属和抗氧化物基因工程
• 1.5 木材品质改良基因工程
• 1.5.1 降低木质素含量的基因工程
• 1.5.2 调整木质素结构的基因工程
• 1.6 生殖发育调控基因工程
• 1.7 rd29A 基因研究现状
• 2 国槐组织培养研究现状
• 2.1 国槐离体再生及抗虫基因sck 的导入
• 2.2 槐树幼嫩叶片培养及植株再生
• 2.3 槐树子叶培养及植株再生
• 2.4 槐树花药培养及植株再生
• 2.5 抗生素对槐树再生能力的影响
• 3 沙柳组织培养研究现状
• 3.1 快繁体系建立及植株再生
• 3.2 花序的离体培养和植株再生
• 3.3 原生质体培养
• 3.4 柳树的遗传转化
• 4 本研究的目的和意义
• 5 技术路线
• 第二章 沙柳再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 植物激素
• 1.1.3 基本培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 无菌体系的建立
• 1.2.2 影响茎段芽生长及增殖的因素
• 1.2.2.1 基本培养基
• 1.2.2.2 激素种类及浓度
• 1.2.3 影响愈伤组织形成的因素
• 1.2.4 激素对愈伤组织分化芽的影响
• 1.2.5 影响根诱导的因素
• 1.2.6 培养条件
• 1.2.7 评价指标
• 2 结果与分析
• 2.1 无菌体系的建立
• 2.2 芽生长及增殖的影响因素
• 2.2.1 基本培养基对芽生长及增殖的影响
• 2.2.2 激素浓度和种类对芽生长及增殖的影响
• 2.3 愈伤组织形成的影响因素
• 2.3.1 外植体种类对愈伤组织形成的影响
• 2.3.2 基本培养基对愈伤组织形成的影响
• 2.3.3 暗培时间对愈伤组织形成的影响
• 2.3.4 激素种类及浓度对愈伤组织形成的影响
• 2.4 诱导芽分化
• 2.4.1 不同浓度6-BA 与NAA 组合对芽分化的影响
• 2.4.2 不同浓度6-BA 与IBA 组合对芽分化的影响
• 2.4.3 不同浓度6-BA+KT 与NAA 组合对芽分化的影响
• 2.3.4 不同浓度KT+TDZ 与IBA 组合对芽分化的影响
• 2.4 根的诱导
• 2.4.1 基本培养基对生根的影响
• 2.4.2 NAA 浓度对生根的影响
• 2.4.3 植株的移栽
• 3 讨论
• 3.1 基本培养基对愈伤组织形成的影响
• 3.2 激素对愈伤组织形成的影响
• 3.3 激素对芽诱导的影响
• 3.4 根的诱导
• 4 结论
• 第三章 农杆菌介导的rd29A 基因转化国槐的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 农杆菌培养基及菌培养
• 1.1.4 抗生素
• 1.2 方法
• 1.2.1 Cef 和Carb 抑菌浓度的确定
• 1.2.2 Cef 和Carb 对国槐大叶片愈伤组织诱导及芽分化的影响
• 1.2.3 Kan 和PPT 选择压浓度的确定
• 1.2.4 遗传转化方法
• 1.2.5 转化体系的优化
• 1.2.6 转化植株的PCR 检测
• 1.2.7 转基因植株抗NaCl 测定
• 2 结果与分析
• 2.1 Cef 和 Carb 抑菌效果及对芽分化的影响
• 2.2 Kan 和PPT 浓度对芽分化和再生苗生长的影响
• 2.2.1 芽再生阶段选择抗生素的确定
• 2.2.2 生根阶段Kan 选择压的确定
• 2.2.3 不同菌株和侵染浓度对转化效率的影响
• 2.2.4 外植体类型对转化效率的影响
• 2.2.5 侵染时间对转化效率的影响
• 2.2.6 抽真空对国槐大叶片转化效率的影响
• 2.2.7 预培养时间对转化效率的影响
• 2.2.8 共培养时间对转化效率的影响
• 2.2.9 共培养基中pH 值对转化效率的影响
• 2.2.10 不同选择方法对转化效率的影响
• 3 讨论
• 3.1 抗生素浓度的确定
• 3.2 大叶片的选择
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 图版一 沙柳再生体系建立图片
• 图版二 农杆菌介导的国槐rd29A 基因转化图片