一种抗草甘膦基因的发现和抗草甘膦转基因水稻的培育

论文摘要

草甘膦是一种广谱灭生性除草剂,是目前世界上用量最大的除草剂。其作用机制是草甘膦抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase,EPSPS）,导致莽草酸合成途径中断,植物所必须的芳香族氨基酸不能合成,最终导致植物死亡。草甘膦直接使用在农田会造成作物的伤害,甚至死亡。将抗草甘膦的EPSPS基因转入植物体内培育抗草甘膦作物,就可直接在田间使用草甘膦来控制杂草。水稻是世界上最主要的粮食作物,世界上近一半人口,包括几乎整个东亚和东南亚的人口,都以稻米为食。杂草危害是水稻减产的最主要原因之一。发现抗草甘膦基因,培育抗草甘膦水稻对提高水稻产量、品质和解放劳动力具有重要的意义。本论文从严重草甘膦污染的土壤中分离出一株高抗草甘膦菌株,该菌株可耐受200mM的草甘膦浓度。通过16S rDNA和扫描电镜分析,初步认定为假单胞杆菌,暂命名为假单胞杆菌G6。利用PCR方法扩增假单胞杆菌G6基因组,得到了G6基因。氨基酸序列分析表明,G6基因和ClassⅡEPSPS同源性较高,含有EPSPS蛋白特有的保守结构域、模式和保守氨基酸。通过蛋白结构建模显示G6基因三级结构。通过生物信息学分析初步确定克隆到的G6基因可能具有抗草甘膦特性。为验证克隆到基因具有抗草甘膦活性,将G6基因插入pET-28载体,构建了pET-G6原核表达载体。将其转入BL21（DE3）中进行草甘膦抑制下的细胞生长实验。实验表明在含50mM和100mM草甘膦的M63液体培养基中,细胞生长良好,但在含150mM草甘膦的M63液体培养基中,细胞的生长在前期受到了明显的抑制。验证了G6基因具有抗草甘膦活性,将携带有pET-G6质粒的BL21（DE3）细胞进行了诱导表达。SDS分析表明,G6蛋白能在大肠杆菌中大量表达,蛋白质分子量约46KDa。对表达的蛋白进行了初步的纯化并制备了多克隆抗体,为以后的抗草甘膦转基因作物的检测打下了基础。根据水稻密码子的偏爱性,重新合成了G6基因。并在G6基因的5′端加入了叶绿体信号肽,该信号肽来源于玉米的乙酰乳酸合成酶（acetohydroxyacidsynthase）;G6基因3′端加终止子片段,终止子片段来源于玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）。合成的G6基因和玉米ZmUbi-1启动子克隆到pCAMB1300载体中,得到了植物双元表达载体pCAMB1300-ZmUbi-G6sy。采用农杆菌侵染法与粳稻（Oryza sativa L.ssp.japonica）秀水11愈伤共培养进行转化,对转化得到的植株进行了分子鉴定,结果显示G6基因已整合进水稻基因组中。对T0植物进行了草甘膦敏感性测试,在喷洒稀释50倍、25倍和16.6倍10%草甘膦水剂的情况下,生长良好。对T1植物进行了草甘膦敏感性测试,在喷洒稀释100倍、50倍、25倍10%草甘膦水剂的情况下,生长良好;在喷洒稀释12.5倍10%草甘膦水剂的情况下,部分株系生长受到一定抑制。本研究克隆到具有独立知识产权的抗草甘膦基因,并将其转入水稻培育了抗草甘膦水稻,对我国水稻产量和品质的提高,方便的田间管理具有重要的意义。另外,G6基因不仅可以用来培育抗草甘膦作物,还可以用来做为筛选标记等,具有重要的应用价值。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 草甘膦的生产及其发展
• 2 草甘膦性质及作用机理
• 2.1 草甘膦的理化性质
• 2.2 草甘膦作用特点
• 2.2.1 良好的内吸性和极宽的杀草谱
• 2.2.2 不易产生抗药性
• 2.2.3 安全、无害
• 2.3 草甘膦毒性机理
• 3 生物抗草甘膦的机理
• 4 草甘膦靶标酶EPSPS的研究现状
• 4.1 EPSPS的分类
• 4.2 EPSPS定位
• 4.3 EPSP合成酶的三维结构与活性区
• 4.4 EPSPS基因的克隆及分子生物学研究
• 5 抗草甘磷转基因作物的选育途径及研究进展
• 5.1 转基因的概念
• 5.2 抗草甘膦转基因作物的选育途径
• 5.3 抗草甘膦转基因作物的研究进展
• 6 抗草甘磷转基因水稻的研究现状
• 6.1 植物遗传转化方法及特点
• 6.1.1 农杆菌介导的基因转移
• 6.1.2 基因枪介导的基因转移
• 6.1.3 PEG介导的基因转移
• 6.1.4 花粉管导入法介导的基因转移
• 第二章 抗草甘膦G6基因的克隆、表达及草甘膦抑制下生长曲线的建立
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 工具酶及试剂盒
• 1.1.3 菌株和载体
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 SDS-PAGE电泳分析所用的试剂
• 1.1.6 Western blot分析所用的试剂
• 1.1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测所用的试剂
• 1.1.8 其它试剂
• 1.1.8 实验动物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株的分离与纯化
• 1.2.2 菌株的鉴定
• 1.2.3 抗草甘膦G6基因的克隆
• 1.2.4 抗草甘膦G6基因的原核表达和草甘膦抑制下生长曲线的建立
• 1.2.5 目的蛋白的纯化回收及抗体制备
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株的鉴定
• 2.1.1 16S rDNA鉴定
• 2.1.2 G6菌株的电镜观察
• 2.2 G6基因的扩增
• 2.3 G6蛋白的生物信息学分析
• 2.3.1 G6蛋白一级结构分析
• 2.3.2 G6蛋白二级结构分析
• 2.3.3 G6蛋白质三级结构分析
• 2.4 抗草甘膦G6基因的原核表达和草甘膦抑制下生长曲线的建立
• 2.4.1 原核表达载体的构建
• 2.4.2 草甘膦抑制下生长曲线的建立
• 2.4.3 G6原核表达和SDS-PAGE分析
• 2.5 目的蛋白的纯化和抗体的制备
• 2.5.1 目的蛋白的纯化
• 2.5.2 抗体的制备和效价检测
• 3 讨论
• 第三章 抗草甘膦转基因水稻的培育
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 试剂与仪器
• 1.1.4 实验用溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 植物表达载体的构建
• 1.2.2 农杆菌感受态的制备和转化
• 1.2.3 水稻的转化
• 1.2.4 植物总DNA提取（CTAB法）
• 1.2.5 转G6抗草甘膦基因植株的PCR鉴定
• 1.2.6 Western blot分析
• 1.2.7 Southern印迹分析
• 0和T₁转基因水稻抗性实验'>1.2.8 T₀和T₁转基因水稻抗性实验
• 2 结果与分析
• 2.1 载体构建
• 2.2 抗草甘膦转基因植株的获得
• 0代抗草甘膦植株的PCR检测'>2.3 T₀代抗草甘膦植株的PCR检测
• 0代抗草甘瞵植株的Western blot检测'>2.4 T₀代抗草甘瞵植株的Western blot检测
• 0代抗草甘膦植株的Southern blot检测'>2.5 T₀代抗草甘膦植株的Southern blot检测
• 0代转基因水稻抗性实验'>2.6 T₀代转基因水稻抗性实验
• 1代转基因水稻抗性实验'>2.7 T₁代转基因水稻抗性实验
• 3 讨论
• 总讨论
• 参考文献
• 缩写与中英文对照
• 附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器
• 附录B 实验用溶液及培养基配方