741毛白杨APX基因的克隆及表达分析

论文摘要

在环境胁迫的条件下,植物细胞中会有大量活性氧积累,若不能及时有效地清除积累的活性氧,则会对植物造成伤害。抗坏血酸过氧化物酶（APX）是植物体内抗坏血酸—谷胱甘肽循环（AsA-GSH）脱毒系统的一种重要的酶类,APX是含有血红素的蛋白质,可以清除植物体内的过氧化氢（H202）,进而提高植物抵抗外界环境胁迫的能力。本文的研究主要以741毛白杨为实验材料,克隆得到两个APX基因,并将它们转入烟草植株中,分析研究了APX基因对植物抗盐和抗干旱胁迫的作用。主要研究内容和实验结果如下：1.因为毛白杨与毛果杨具有高度同源性,根据毛果杨基因序列,用电子克隆的方法,推断出两条毛果杨APX编码序列,再通过提取毛白杨RNA逆转录cDNA,以毛白杨cDNA为模板,依据推断的两个毛果杨APX序列设计引物,成功克隆出两个741毛白杨APX基因编码序列,分别命名为APX-Ⅰ和APX-Ⅱ。2.分别构建了APX-Ⅰ-PBI121和APX-Ⅱ-PBI121两个转基因表达载体,将转基因载体转化农杆菌LBA4404,用叶盘法侵染烟草,用100mg/L Kan来筛选转APX基因的烟草植株,通过southern杂交鉴定出成功转APX-Ⅰ和APX-Ⅱ基因的烟草各三个株系。3.对获得的转APX-Ⅰ和APX-Ⅱ基因的烟草进行抗盐胁迫和抗干旱胁迫实验。实验结果表明,与对照的非转基因烟草相比,转APX-Ⅰ和APX-Ⅱ基因的烟草具有更好的抗盐胁迫和抗干旱胁迫能力,所以分析认为抗坏血酸过氧化物酶（APX）很可能对提高烟草抗盐胁迫和抗干旱胁迫能力起着至关重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1. 引言
• 1.1 抗坏血酸过氧化物酶简介
• 1.2 APX的反应机制
• 1.3 APX基因家族概述
• 1.4 APX酶在细胞中的定位
• 1.5 APX基因的分子生物学研究
• 1.5.1 核酸信息
• 1.5.2 氨基酸信息
• 1.5.3 APX基因的克隆
• 1.6 APX基因的酶学特征及研究现状
• 1.6.1 APX的酶学特征
• 1.6.2 酶活性的研究
• 1.7 APX基因的表达分析
• 1.7.1 基因的表达
• 1.7.2 APX转基因的正义表达和反义表达
• 1.8 APX研究目的及展望
• 2. 毛白杨APX基因的克隆
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 电子克隆实验材料
• 2.1.2 APX基因克隆实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 毛果杨APX基因电子克隆的方法
• 2.2.2 毛白杨APX基因克隆的方法
• 2.2.2.1 试剂准备及仪器预处理
• 2.2.2.2 提取RNA
• 2.2.2.3 逆转录
• 2.2.2.4 设计引物
• 2.2.2.5 PCR反应
• 2.2.2.6 PCR扩增产物的回收
• 2.2.2.7 PCR产物与pMD19-T载体连接
• 2.2.2.8 连接产物转化大肠杆菌JM109
• 2.2.2.9 鉴定转化结果及菌液测序
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 毛果杨APX基因电子克隆的结果
• 2.3.1.1 大豆AY466858序列的获得
• 2.3.1.2 毛果杨APX基因序列的获得
• 2.3.2 毛白杨APX基因克隆的结果
• 2.3.2.1 RNA提取结果
• 2.3.2.2 APX-Ⅰ和APX-Ⅱ的引物PCR结果
• 2.3.2.3 毛白杨APX基因测序结果
• 2.4 小结
• 3. 毛白杨APX基因的载体构建及转化
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 毛白杨APX转基因载体构建的方法
• 3.2.1.1 添加酶切位点的引物设计
• 3.2.1.2 目的基因片段APX的T载体克隆
• 3.2.1.3 转基因载体PBI121-APX的构建
• 3.2.2 毛白杨APX基因转化烟草的方法
• 3.2.2.1 烟草扩繁及敏感性试验
• 3.2.2.2 农杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.2.3 质粒转化农杆菌感受态细胞
• 3.2.2.4 农杆菌叶盘法侵染烟草
• 3.2.3 转毛白杨APX基因烟草鉴定的方法
• 3.2.3.1 转毛白杨APX基因烟草的PCR检测
• 3.2.3.2 转毛白杨APX基因烟草的Southern杂交
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 毛白杨APX转基因载体构建的结果
• 3.3.1.1 添加双酶切位点的APX基因PCR结果
• 3.3.1.2 目的基因APX连接pMD19-T载体及测序结果
• 3.3.1.3 目的基因APX与转基因载体PBI121连接结果
• 3.3.2 毛白杨APX基因转化烟草的结果
• 3.3.2.1 Apx-PBI121转化农杆菌感受态细胞的结果
• 3.3.2.2 农杆菌侵染烟草结果
• 3.3.3 转毛白杨APX基因烟草鉴定的结果
• 3.3.3.1 转基因烟草的PCR检测
• 3.3.3.2 转基因烟草的Southern杂交检测
• 3.4 小结
• 4 转APX基因植株的抗逆性分析
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 抗盐性分析的实验方法
• 4.2.2 抗旱性分析的实验方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 抗盐性分析的实验结果
• 4.3.2 抗旱性分析的实验结果
• 4.4 小结
• 5 毛白杨APX-Ⅰ在烟草细胞中的表达定位
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 毛白杨APX-I-PBI121-GFP载体构建的方法
• 5.2.1.1 引物设计
• 5.2.1.2 构建PBI121-GFP载体
• 5.2.1.3 构建APX-I-PBI121-GFP载体
• 5.2.2 载体转化农杆菌并侵染烟草细胞的方法
• 5.2.2.1 制备烟草悬浮细胞
• 5.2.2.2 APX-I-PBI121-6FP载体转化农杆菌
• 5.2.2.3 农杆菌侵染烟草悬浮细胞
• 5.2.2.4 荧光显微镜观察转化细胞
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 毛白杨APX-I-PBI121-GFP载体构建的结果
• 5.3.1.1 载体PBI121-GFP构建结果
• 5.3.1.2 载体APX-I-PBI121-GFP构建结果
• 5.3.2 载体转化农杆菌并侵染烟草细胞的结果
• 5.3.2.1 APX-I-PBI121-GFP载体转化农杆菌结果
• 5.3.2.2 荧光显微镜观察结果
• 5.4 小结
• 6 结论及讨论
• 6.1 结论
• 6.2 讨论
• 参考文献
• 附录
• 个人简介
• 导帅简介
• 致谢